孕妇外周血中低胎儿游离DNA浓度及处理方案

赵干业 孔祥东*

（郑州大学第一附属医院遗传与产前诊断中心，河南郑州 450000）

基于孕妇外周血中游离DNA（cell free DNA，cf DNA）的无创产前检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）技术在筛查胎儿染色体非整倍体及染色体微缺失微重复等疾病中发挥了重要作用。cfDNA中胎儿游离DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）所占的比例，即cffDNA浓度（fetal fraction，FF）是保证NIPT检测准确性的重要指标，较低的FF会影响NIPT对胎儿染色体异常的检出，使假阴性的风险升高，故在NIPT检测过程中对FF设有最低的检测阈值，若不达标即判定为检测失败。FF不足已成为导致NIPT检测失败的重要因素之一。现有研究表明可能影响FF的因素众多［1］，对此的深入认识有利于对此类人群进行更合理的遗传咨询和妊娠期管理。现就相关因素及后续如何处理进行综述。

1 孕妇外周血中的游离DNA

孕妇外周血中的cfDNA，由占据大部分的孕妇自身cf DNA和占据小部分的cffDNA共同组成，其中孕妇自身的cfDNA主要来源于造血系统，同时其他的母体器官包括肿瘤也会向母体血浆中释放cfDNA［2-4］；cffDNA则主要由胎盘滋养层细胞的凋亡和坏死形成［5，6］，这也是cffDNA的主要特点之一。此外，cffDNA含量随孕周增大，呈上升趋势［7］；胎儿分娩后cffDNA会被快速清除［8］；母源cfDNA片段长度比cffDNA要长；cffDNA虽为短片段，但其可拼凑出完整的胎儿基因组信息［9］。

2 胎儿游离DNA与NIPT

当胎儿出现染色体异常时，其释放入孕妇外周血中的cffDNA会使相关染色体的比例发生变化，通过高通量测序的方法对这种变化进行检测即可对胎儿的染色体异常情况进行评估，这也即是NIPT的基本原理［10］。为确保对胎儿染色体异常评估的准确性，充足的cffDNA是必要条件［11，12］。不同检测平台对FF最小阈值的设定略有差异，一般介于2%～4%之间，低于设定阈值，则判定为检测失败［13］。

3 胎儿游离DNA浓度低相关的因素

任何可能影响母体或胎盘cfDNA释放的因素均可能影响FF，而通过促进母体cfDNA的升高和／或促进胎盘cf DNA的降低即可导致FF降低。与之相关的因素主要有生物因素和实验因素等。

3.1 生物因素 生物因素又分母体因素和胎儿因素。

3.1.1 母体因素 BMI：诸多研究表明FF与孕妇BMI呈负相关，过度肥胖的孕妇其自身因炎症和坏死的脂肪细胞更多，使得母体来源的cfDNA增多，而胎盘来源的cffDNA不变或者可能降低，进而使得cffDNA的浓度降低［14］。

年龄：有的研究认为孕妇年龄与FF呈负相关［15］，而有的研究则认为无影响［16］。

人种：来自美国的一项研究显示，在低FF人群中，非裔美国人明显占比更高［17］，而澳大利亚的一项研究则显示南亚人群中更容易出现低FF［18］。但同时也有研究显示低FF与人种相关性不大［19］。

辅助生殖：有研究显示，辅助生殖（in-vitro fertilization，IVF）样本的FF要低于自然妊娠［20］，这一方面可能与激素治疗或者胎盘功能损伤进而影响cff DNA的释放有关，另一方面则可能与IVF导致孕妇自身cf DNA升高也有关［21］；丹麦的一项研究显示辅助生殖不仅可使FF降低，且移植新鲜胚胎比冷冻胚胎的FF要低［22］。但也有研究显示IVF对FF并无影响［23，24］。

血清学指标：PAPP-A和freeβ-hCG水平和FF正相关，检测失败人群中二者水平一般较低［25］，这两者来源于胎盘的蛋白，其水平反映了胎盘功能和胎盘体积以及胎盘与母体接触面积等情况［26，27］。

母体疾病：系统性红斑狼疮［28］、B12缺乏［29］等与FF低而反复检测失败有关，而FF在治疗或抑制疾病后得到改善。

药物：为了治疗母体某些疾病而使用的相关药物与低FF也被证明有一定的相关性，如有研究报道抗凝剂如低分子肝素等的使用和低FF导致的检测失败率升高有关［30，31］，但也有研究表明导致FF降低的原因是低分子肝素所治疗的疾病本身，而非低分子肝素的使用［32］。

运动：丹麦的一项研究显示，在运动后和运动前相比，FF降低了1%～17%，但30分钟后，该影响即消失，可能原因是运动提高了孕妇自身cfDNA的含量，而cff DNA的量则未变［33］。

妊娠期并发症：低FF被发现与妊娠期并发症的风险增加有关，荷兰一项研究显示低FF孕妇发生妊娠期高血压、晚发型先兆子痫和妊娠期糖尿病的概率升高，而这些异常很可能与孕早期胎盘出现异常有关，值的注意的是该研究显示低FF与早发型子痫前期无相关性，但不能排除样本量对此结论的影响［34］。美国的一项研究同样显示妊娠期高血压疾病和子痫前期风险增加的孕妇在妊娠早期FF较低［35］。此外，对于妊娠期糖尿病，因BMI和低FF及妊娠期糖尿病都有关，有研究显示在排除了BMI的影响后，并未发现低FF和妊娠期糖尿病之间有关联［36］。

3.1.2 胎儿因素 孕周：孕周与FF呈正相关［7］。

胎儿性别：有研究显示女胎FF比男胎的高［37］。

胎儿异常情况：出生体重较低的胎儿其FF一般较普通胎儿的要低［38］，也有研究显示宫内生长受限的胎儿其FF也较低［39］。多项研究报道低FF的胎儿13三体、18三体、45，X以及三倍体的风险增高［40，41］，但与21三体风险不相关。这与胎盘大小可能有关，有报道显示13三体、18三体、45，X和三倍体胎儿的胎盘一般较小，其释放的cffDNA也就较少。而对于21三体胎儿，有研究报道其胎盘质量则相对较大。当然，这样的结论可能受到不同人群产诊率不同、不同平台不同定量方法等所影响［41］。而也有研究得出不同的结论，即低FF样本中最终发生染色体异常的风险并无增高［42，43］。

3.2 实验因素

3.2.1 采血管 用普通的K3 EDTA抗凝管采血，其FF在第二天时降低48.5%，而在第4天时即可降低80%［44］，故样本若不能立即处理，一般选用cfDNA专用保存管进行血液采集。

3.2.2 运输温度 一项研究显示当运输温度维持在4℃左右，母源cfDNA就会变多，进而使总的cfDNA增多，而cffDNA不变，最终使FF降低［45］，而运输温度过高也会影响cfDNA的组成［46］，因此一般选用常温进行运输。

3.2.3 样本的保存方式 有研究显示冻融后的血浆，其FF会降低［47］。一项研究显示血浆中FF在-25℃条件下保存2年后即会出现下降趋势。然而，提取后的cfDNA，在-25℃保存18个月后FF依然没有变化，但保存3年后，和立即检测相比，FF增加了27%［48］。

3.2.4 FF的计算方法［49］FF的计算一般皆基于母源cfDNA和cffDNA之间的不同之处，而用于FF的计算方法有很多种，主要有①基于Y染色体估算法：因孕妇血浆中的Y染色体序列只可能来自于胎儿，故基于此对男性胎儿的游离DNA进行准确计算，但其无法应用于女胎样本。②基于SNP的方法：选取父亲和母亲皆为纯合但基因型不同的位点，运用胎儿特异性的位点进行胎儿游离DNA浓度的计算，所得浓度准确，但需要获得父亲基因型。升级版的方法如FetalQuant和FetalQuantSD，不需要父亲基因型，但需要提高测序深度或者构建适用于不同群体和平台的参数模型。③seqFF：基于胎儿游离DNA和母源游离DNA测序时所得数据的不同特点来进行，可直接利用NIPT测序过程中所产生的数据，但当cffDNA浓度低于5%时准确性差。④基于甲基化的方法：基于胎儿游离DNA和母源游离DNA甲基化不同，但甲基化测序成本较高。⑤基于cf DNA长度差异：根据胎儿cfDNA片段较母体cfDNA片段短的特点来进行检测，但准确性一般。⑥基于核小体的方法：由于核小体的影响，母源游离DNA和胎儿游离DNA的测序序列各有自己的一些特点，基于此可进行游离DNA浓度检测，但其测定的准确性差，需进一步优化。

FF计算方法多样，各有优缺点及适用场景，但不同方法之间计算有差异，同样的样品运用不同的方法所得到的浓度有不同，有研究显示运用基于SNP的方法计算浓度和基于Y染色体的方法相比，其浓度会降低7%［50］，因此有研究建议可联合使用多种方法进行FF的计算，特别是对于FF低的样本，以避免由于计算方法误差导致的假性FF降低［51］。

4 胎儿游离DNA浓度低后续处理

4.1 重采血 FF随孕周升高而升高，因此在较大孕周再次采血可提高检测成功率，但重采血的成功率不同研究报道有差异，50%～94.12%不等［13，43］。

4.2 通过实验方法提高cffDNA浓度 通过在实验流程中对相关步骤进行优化，可在一定程度上提高FF，如cfDNA的富集、测序条件的优化、生物信息学算法的改进等［52，53］。有研究从总cf DNA中筛选较短的cfDNA片段，使FF增加了99%～359%［53］，但缺点是增加了检测成本。

4.3 侵入性产前诊断 因有研究表明FF低胎儿异常妊娠率会增高，故有些专家建议直接进行侵入性产前诊断［54］。

4.4 选择其他联合筛查方式 若通过重采血等方式依然无法解决NIPT检测失败的问题，同时孕妇又拒绝侵入性产前诊断的方式，则只能选择目前已有的其他常用的筛查方式，如结合血清学筛查和超声等方式对胎儿的情况进行综合评估［55］，但若筛查结果伴随严重的结构异常等，仍需要进一步建议其进行侵入性产前诊断。

4.5 各个指南中的建议 目前国际上各个相关协会和组织针对FF低问题，也有相应的建议和指导。

国际产前诊断协会（International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD）在2015年的声明中表示FF降低的意义仍在研究中，是否与染色体异常有关尚无明确结论，而选择重采血有1／3的失败率，故建议需结合孕周、超声结果以及孕妇个人意愿等重新评估选择是否重采血［56］。2020年发布的关于双胎NIPT检测的声明显示FF低选择重采血的成功率为53%～83%，对FF低的建议是进行超声检测或者产前诊断，只有在时间允许情况下可考虑重采血［57］。2023年发布的最新声明显示，针对FF低样本可选择进一步详细的超声检查、重采血进行NIPT二次检测、其他的筛查方法或者产前诊断等方式［58］。

美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）2016年发布的指南建议FF低孕妇行产前诊断，而非重采血［54］，但其于2023年发布的最新指南则去掉了这一条，并未给出明确建议［59］。

美国妇产科医师学会（Americal college of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）和母胎医学会（Society for Maternal-Fetal Medicine，SMFM）于2015年和2020年发布的指南皆显示需告知NIPT检测失败孕妇胎儿染色体异常风险升高，需进一步接受综合的遗传咨询，并接受进一步的超声检测和诊断。是否选择重采血则需要结合胎儿的孕周以及其他的检测结果综合判定，若胎儿孕周较大可能影响后续的产诊或者超声已有提示较严重的异常，则不建议重采血［60，61］。

5 小结

随着相关研究的不断增多，和FF低相关的因素越来越多的被报道，其中和母体相关的因素有BMI、年龄、人种、辅助生殖、母体自身疾病、药物的使用以及血清学标志物如PAPP-A和freeβ-hCG水平等，和胎儿自身相关的因素则有孕周、胎儿性别以及胎儿的异常情况如18三体、13三体及宫内生长受限等，和NIPT检测过程中相关的因素有样本采集、运输、保存及FF的计算方法等。但其中也有诸多因素在不同的研究中有不一致的结论，如孕妇年龄、辅助生殖、人种及胎儿染色体异常情况等，因此未来需要更深入的研究来进一步探讨这些影响因素。而对于FF低的后续处理，一方面，实验室人员可通过优化实验流程如通过富集cffDNA提高FF、优化相关算法等方式降低因FF低而导致的失败率，另一方面，遗传咨询医生则需结合孕妇的孕周、超声等其他检测结果及其个人意愿进行咨询。在无严重超声异常及孕周适中的情况下，可选择重采血进行二次检测，反之，则建议进行侵入性产前诊断，当拒绝重采血和侵入性产前诊断时，则可通过联合其他如超声和血清学筛查的方式对胎儿的异常情况进行综合评估。