基于数据挖掘和网络药理学探究含黄芩-白芍药对的方剂治疗溃疡性结肠炎的配伍规律及作用机制Δ

周佳林,刘 翔,饶 颖,黄雪云,陈嘉琪,吴 娜#

(1.江西中医药大学研究生院,南昌 330000; 2.江西中医药大学附属医院肝胆科,南昌 330000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种慢性非特异性炎症性肠病,临床表现主要为腹痛、腹泻、黏液脓血便、营养不良和消瘦等[1]。近年来,UC的发病率逐年升高,严重威胁人类健康[2]。中医药治疗UC的研究逐渐成为热点,且疗效确切,不仅有助于缓解UC患者的各种临床症状,而且可以有效提高患者生活质量。随着网络药理学的兴起,从分子机制探讨中药成分靶向治疗疾病的作用机制的研究越来越多。黄芩汤和芍药汤是中医治疗UC的经典方剂,而黄芩-白芍作为其中的核心药对组合在治疗UC中十分重要。研究结果表明,黄芩的核心成分黄芩苷能抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)1β、和IL-8的表达水平,从而削弱UC模型大鼠的肠道黏膜炎症损伤[3]。多项研究结果显示,白芍的核心成分芍药苷具有抗炎、抑癌、护肝、调节免疫及调控细胞增殖与凋亡等多重药理作用[4-5]。芍药苷对三硝基苯磺酸造模的UC小鼠模型具有良好的抗炎效果[6]。本研究利用数据挖掘、网络药理学等现代技术,筛选得出含黄芩-白芍的方剂的药物配伍规律及其治疗UC的潜在分子机制,并通过分子对接验证结果。

1 资料与方法

1.1 资料来源

在中国知网中,以“溃疡性结肠炎”和“‘黄芩’ or ‘白芍’”为关键词进行检索,检索时间为建库至2021年12月。

1.2 纳入标准

不论单盲、双盲或非盲法的临床随机对照试验的中文文献。给药途径限定为口服,研究组干预措施为单纯中药、中成药或中药/中成药联合西药治疗;对照组干预措施为西医治疗(包括水杨酸制剂、生物制剂、激素和免疫抑制剂等)。

1.3 排除标准

给药途径包含中药灌肠的文献;无具体药物组成的文献;仅使用单味中药治疗的文献;黄芩-白芍不是主方用药,只出现在随证加减中的文献;学术经验类、综述类、动物实验类文献。

1.4 数据标准化

将检索得到的中药处方按照依据《中华人民共和国药典:一部》(2020年版)、《中华本草》将产地不同和炮制不同等药物进行规范化处理。

1.5 数据分析

运用Excel软件对中药处方进行频数统计分析,并利用中医辅助计算平台分析所有药物的四气、五味、归经及功效。利用IBM SPSS Model 18.0软件对中药复方处理,得出高频药物;基于Apriori算法进行关联规则分析,选择支持度百分比≥30%、置信度百分比≥90%且增益≥1为含黄芩-白芍的核心药物组;将高频药物通过IBM SPSS Statistics 26软件进行聚类分析。

1.6 含黄芩-白芍核心药物组的活性成分、靶点及UC疾病靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php),以口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18为条件,筛选含黄芩-白芍核心药物组的有效成分及靶点;通过DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/search),以“Ulcerative colitis”为搜索词筛选出UC的疾病靶点;将两者靶点映射,即为含黄芩-白芍核心药物组治疗UC的潜在靶点。

1.7 构建中药-成分-靶点网络图

利用Cytoscape 3.7.2软件,将“核心药物组、有效活性成分、核心药物组治疗UC的潜在靶点”进行可视化分析。

1.8 构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络及获取关键靶点

将映射靶点导入STRING数据库和Cytoscape 3.7.2软件,并分析计算靶点的度值。

1.9 京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

将潜在靶点利用R语言x64 4.1.2软件进行KEGG可视化分析,并根据q值选择排序居前30位的靶点绘制气泡图。

1.10 分子对接

运用AutoDockTools 15.7将核心药物组中药的主要核心成分与核心靶点一一进行分子对接,以初步验证中药核心成分能否与核心靶点蛋白有效结合。并通过RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)和Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)分别获取靶点蛋白和配体结构,并运用PyMol 2.4.0绘制对接模式图。

2 结果

2.1 含黄芩-白芍药对和方剂的统计与分析

共筛选出符合要求的方剂218首,其中包含146味中药,并导入中医传承计算平台3.0软件,统计其四气、五味、归经及功效。146味中药中,出现频数≥10次的药物共有44味,合计频数为2 243次,见图1。

A.四气统计雷达图;B.五味统计雷达图;C.归经统计雷达图;D.功效统计A.statistical radar chart of the four properties;B.statistical radar chart of the five flavors;C.statistical radar chart of the meridian tropism;D.statistics of efficacy图1 药物组成的四气、五味、归经和功效统计分析Fig 1 Statistical analysis on the four properties, five flavors, meridian tropism and efficacy of drug components

2.2 IBM SPSS Model 18.0软件分析结果

2.2.1 高频药物:选择出现频数≥25次的26味中药视为高频药物,见表1。

表1 含黄芩-白芍药对的方剂治疗UC的高频药物Tab 1 High frequency medicine containing radix scutellariae-radix paeoniae alba herb pair in the treatment of UC

2.2.2 关联规则分析:运用Apriori算法对方剂进行关联规则分析,选择支持度百分比≥30%、置信度百分比≥90%、增益≥1且为含黄芩-白芍的核心药物组,其中黄连、甘草、木香、白术、当归、白头翁与黄芩-白芍药对相关联的支持度最高(见表2),且与高频药物的结果相吻合。

表2 含黄芩-白芍药对的方剂治疗UC的核心药物组Tab 2 Core drug group of couplet medicines of scutellaria baicalensis-paeonia lactiflora in the treatment of UC

2.3 聚类分析

运用IBM SPSS Statistics 26软件对高频药物中频数≥25次的26个药物使用系统聚类方法,选择“组间连接”和“皮尔逊相关性”(见图2),设置区间距离为20,可将高频药物分为8类,见表3。

图2 高频药物的聚类分析图Fig 2 Cluster analysis diagram of high frequency medicine

表3 药物分类(区间距离为20)Tab 3 Drug classification (with interval distance of 20)

2.4 含黄芩-白芍的核心药物组的有效成分、靶点与UC疾病靶点

按照条件筛选,得到黄芩36个成分,白芍13个成分,黄连14个成分,甘草92个成分,木香6个成分,白术7个成分,当归2个成分,白头翁11个成分;将含黄芩-白芍的核心药物组的中药靶点与UC疾病靶点映射成功后共得到104个靶点。运用Cytoscape 3.7.2软件构建含黄芩-白芍核心药物组治疗UC潜在靶点的中药-成分-靶点网络图,见图3。

图3 含黄芩-白芍的核心药物组治疗UC潜在靶点的中药-成分-靶点网络Fig 3 TCM-component-target network of potential target in core drug group of couplet medicines of scutellaria baicalensis-paeonia lactiflora in the treatment of UC

2.5 构建PPI网络及提取核心靶点

将映射成功的靶点利用STRING数据库进行string分析,导入Cytoscape 3.7.2软件通过network analyzer插件进行网络拓扑计算度值,排序居前8位的靶点依次为蛋白激酶B(Akt)1(度值:81)、IL-1β(度值:74)、肿瘤蛋白53(TP53)(度值:70)、血管内皮生长因子A(VEGFA)(度值:69)、环氧合酶2(PTGS2)(度值:69)、转录激活因子3(STAT3)(度值:65)、表皮细胞生长因子(EGF)(度值:64)和趋化因子8(CXCL8)(度值:64)。

2.6 KEGG分析

将潜在靶点利用R语言4.1.2软件进行KEGG可视化分析,按照q值排序,包括晚期糖基化终末产物(AGE)-AGE受体(RAGE)、TNF-α、核因子κB(NF-κB)及IL-17等前30位的信号通路气泡图见图4。

图4 含黄芩-白芍的核心药物组治疗UC潜在靶点的KEGG通路(q值排序居前30位)Fig 4 KEGG pathways of potential target in core drug group of couplet medicines of scutellaria baicalensis-paeonia lactiflora in the treatment of UC (top 30 ranked by q value)

2.7 分子对接

为初步验证药物组的有效成分能否有效结合受体蛋白而发挥治疗UC的效果,根据《中华人民共和国药典:一部》(2020年版)及文献查询,得出黄芩、白芍、黄连、甘草、木香、白术、当归和白头翁的主要核心成分,分别为黄芩苷、芍药苷、小檗碱、去氢木香内酯、苍术酮、阿魏酸和白头翁皂苷B4。根据PPI结果,得出度值排序居前8位的靶点分别为Akt1、IL-1β、TP53、VEGFA、PTGS2、STAT3、EGF和CXCL8。将每个中药的主要核心成分分别与核心靶点进行分子对接验证,以配体(靶点蛋白)与受体(中药主要成分)连接是否有足够多或强的相互作用力(如氢键)来维持来初步评估其连接的稳定性,结果见表4。其中,黄芩、白芍、甘草以及白头翁的主要成分均与Akt1、IL-1β、TP53、VEGFA、PTGS2、STAT3、EGF和CXCL8受体蛋白很好地结合,并展示部分分子对接模式图,见图5。

表4 治疗UC潜在靶点与药物核心成分的分子对接结果Tab 4 Molecular docking results of potential targets and core drug components in the treatment of UC

3 讨论

根据UC典型的腹泻、黏液脓血便和里急后重等临床表现,可将其归属于“久痢”“肠澼”范畴[7]。其病理性质属于本虚标实,活动期多属实证,主要病机为湿热蕴阻于肠,气血不调[8]。

本研究利用数据挖掘的方法收集中国知网中含黄芩-白芍药对的方剂218首,共包含146味中药。本研究与黄芩-白芍配伍治疗UC的方剂多包含清热药、补虚药、行气药、止血药及利水渗湿药,共奏清热燥湿、健脾补虚、行气止血止痛之效。黄芩苦寒泄热,能清肺胃胆及大肠经之湿热,其功效为清热燥湿,泻火解毒。白芍酸苦微寒,归肝脾经,其功效为养血敛阴,缓急止痛。通过数据挖掘和关联规则分析,黄芩-白芍药对与黄连、甘草、木香、白术、当归和白头翁具有强关联,配伍黄连、白头翁清热燥湿解毒,以清蕴结肠道之湿热;配伍木香行气,当归养血调血,以通调气血,达到“气血同治”之功;配伍白术健脾利水,祛壅滞肠道之湿邪;甘草调和诸药,缓其腹痛。

本研究利用网络药理学,从微观挖掘含黄芩-白芍的核心药物组治疗UC的潜在分子机制。KEGG通路富集分析涉及AGE-RAGE、TNF-α、NF-κB和IL-17等与UC密切相关的信号通路。AGE-RAGE信号通路可通过激活磷脂酰肌醇3激酶-Akt信号通路促进炎症因子的磷酸化介导结肠上皮细胞增殖和凋亡。TNF-α属于前促炎细胞因子,可以促进C反应蛋白的释放以加重炎症反应,且有文献报道,TNF-α还可以改善肠道黏膜微循环及促进修复损伤的肠道黏膜组织[9-10]。NF-κB是一种核转录因子,参与机体的炎症反应及免疫调节[11];当发生炎症反应时,促炎因子IL-1β、TNF-α等可激活NF-κB,促使IL-1β、TNF-α的进一步表达,加强炎症反应[12]。研究结果表明,UC小鼠结肠病变组织中NF-κB蛋白的表达明显高于空白对照组[13]。IL-17信号通路被激活后能够促进各种促炎因子的表达,促进Th17细胞的分化,分泌IL-17,从而进一步增强炎症反应[14-15]。

从PPI网络和黄芩-白芍治疗UC的中药-成分-靶点-通路网络(含黄芩-白芍核心药物组治疗UC的潜在靶点的PPI网络)可知,含黄芩-白芍核心药物组治疗UC与Akt1、IL-1β、TP53、VEGFA、PTGS2、CXCL8、EGF及STAT3等蛋白密切相关。研究结果表明,小檗碱通过Akt1抑制巨噬细胞M1极化,在炎症性肠病中表现出抗炎作用[16]。TP53诱导的糖酵解可以减少活性氧引起的细胞损伤,促进细胞增殖和修复,而且研究结果表明,TP53与结肠癌有密切关联[17]。当有炎症反应时,PTGS2表达水平明显高于正常水平,且研究结果表明,UC患者的PTGS2在结肠黏膜的表达水平显著升高,活动期表达水平也明显高于缓解期[18]。IL-1β是引起UC的关键炎症因子,其促进IL-17A、IL-12和γ干扰素等促炎因子的产生,从而加重肠道黏膜的炎症损伤[19]。VEGFA的过表达能促进结肠黏膜的血管增生、血管内皮细胞增殖,增加血管的通透性,而在UC患者中可维持结肠的炎症反应,且VEGFA可作为UC患者癌变的标志物[20-21]。CXCL8为炎症驱化因子,是目前已知的肿瘤增殖及血管生成的诱导物,同时CXCL8的过表达也会促进炎症细胞的聚集而增强炎症反应[22]。EGF是可以作用于结肠黏膜组织的多功能的生长因子,在结肠道黏膜损伤和修复中起到重要作用[23]。STAT3是一种促癌因子,主要来源于结肠病变组织聚集的T细胞和巨噬细胞等炎症细胞,且STAT3在UC动物模型和UC患者的表达都明显升高[24]。

综上所述,含黄芩-白芍的核心药物组治疗UC主要与AGE-RAGE、IL17、Th17、NF-κB和TNF-α等信号通路相关,与Akt1、IL-1β、TP53、VEGFA、PTGS2、CXCL8、EGF及STAT3等核心靶点密切相关,分子对接结果验证了核心药物组中的黄芩、白芍、甘草和白头翁的主要成分均能很好与核心靶点蛋白结合,可推测黄芩、白芍、甘草和白头翁4味药在核心药物组调控核心靶点蛋白中发挥重要作用。本研究可为临床中医药治疗UC提供配伍依据,且为UC的靶向治疗提供一定的研究基础。