苏神合剂挥发性成分分析

陈伟韬，张靖年，肖观林，李养学，杨敏娟，邱锦燕，陈昭，李素梅

[1.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）/广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095；2.广州中医药大学第五临床医学院，广东 广州 510405]

广东气候炎热潮湿，因湿热致病的患者较多，为满足临床需求，广东省第二中医院基于本院多年治疗湿热证的临床验方“苏神方”[1-3]开发了院内制剂苏神合剂，具有芳香健脾、化湿止泻的功效。本制剂气香，处方由紫苏叶、六神曲、豆蔻、陈皮、苍术、甘草等组成，其中君药紫苏叶、臣药豆蔻、苍术富含挥发油，当中成分多与芳香化湿的治疗目的相关[4-13]，但目前未有针对本品挥发性成分的研究报道。本研究通过水蒸气蒸馏法对苏神合剂中挥发性成分进行提取，采用气相-质谱联用仪（GC-MS）检测结合保留指数、对照品确认及归属成分来源药味等方式，分析苏神合剂挥发性成分，通过多批样品检测，确定共有成分，以期为筛选苏神合剂质量评价指标成分提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 7890B-7000D 气相-三重四极杆质谱联用仪（安捷伦科技有限公司）。

1.2 试药

柠檬烯（批号：100470-201503，质量分数：96.0%）、桉油精（批号：110788-201707，质量分数：100.0%）、芳樟醇（批号：111503-202004，质量分数：98.8%）均购自中国食品药品检定研究院；α-蒎烯（批号：AF21081709，质量分数：98%）、β-蒎烯（批号：AF20122009，质量分数：95%）、紫苏烯（批号：AFBG0515，质量分数：98%）、L-α-松油醇（批号：AF20081520，质量分数：97%）、紫苏醛（批号：AF21041412，质量分数：98%）、β-石竹烯（批号：AF20032353，质量分数：98%）均购自成都埃法生物科技公司；34种正构烷烃（C7-C40）混合对照品溶液（批号：D0018994，质量浓度：1 000 μg/mL）购自北京曼哈格生物技术公司。

紫苏叶（批号：220501，产地：广东，生产日期：20220526）、苍术（批号：220601，产地：安徽，生产日期：20220615）购自广东天泰药业公司；豆蔻（批号：220401，产地：云南，生产日期：20220419）购自广州至信中药饮片公司；陈皮（批号：C1722213，产地：广东，生产日期：20220711）购自广东省药材公司，经广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）李素梅副主任中药师和张靖年主管中药师鉴定紫苏叶为唇形科植物紫苏Perillafrutescens（L.）Britt.的干燥叶、苍术为菊科植物茅苍术Atracty‐lodeslancea（Thunb.）DC.、豆蔻为姜科植物白豆蔻AmomumkravanhPierre ex Gagnep.、陈皮为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco的干燥成熟果皮。

苏神合剂（批号：190801、190802、190803、210101、210102、210103、220701、220801、220802、220803）由广东省第二中医院提供。

2 方法与结果

2.1 样品溶液的制备

量取本品100 mL，置250 mL 圆底烧瓶中，连接挥发油提取器，自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，再加环己烷2 mL，按挥发油测定法（《中国药典》2020年版四部通则2204）测定，保持微沸3 h，放冷，分取环己烷层，转移至10 mL量瓶，测定器中水液用乙酸乙酯2 mL 振摇提取，乙酸乙酯液并入同一量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，置填充有无水硫酸钠的0.22 μm 针筒微孔滤膜滤过，即得。

2.2 各药味挥发性成分的提取

依处方分别取紫苏叶、豆蔻、陈皮、苍术等适量，加水100 mL，按“2.1”项自“分取环己烷层……”同法操作，置填充有无水硫酸钠的0.22 μm 针筒微孔滤膜滤过，分别制成紫苏叶、豆蔻、陈皮、苍术挥发性成分提取溶液。

2.3 对照品溶液的制备

取α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、桉油精、芳樟醇、紫苏烯、L-α-松油醇、紫苏醛、β-石竹烯适量，加乙酸乙酯配成含各成分质量浓度为200 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.4 仪器条件

2.4.1 气相色谱条件 HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；分流比30∶1；载气为高纯氦气（≥99.999%）；载气流速1 mL/min；程序升温：初始温度70 ℃，保持3 min，以3 ℃/min的速率升温至280 ℃，保持3 min。

2.4.2 质谱条件 离子源为电子轰击源（EI），离子源温度280 ℃，能量70 eV。质谱传输线温度280 ℃。溶剂延迟4 min。质谱监测模式MS1 扫描模式，扫描范围为50～550m/z，增益5。

2.5 成分鉴定和药味归属

2.5.1 保留指数（IR） 取待测溶液和正构烷烃（C7-C40）混合对照品溶液，测定结果按积分查找化合物，记录各主要化合物的质谱峰保留时间，按以下公式计算各化合物保留指数IR：

式中：IR为目标化合物的保留指数；n为正构烷烃的碳原子数；Tx为目标化合物的保留时间，min；Tn和Tn+1分别为碳原子数为n、n+1 的正构烷烃的保留指数，min，且Tn+1＞Tx＞Tn。

2.5.2 化合物的鉴定和筛选 通过仪器工作站MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 比对NIST 14质谱数据库，检索各化合物质谱图得分高于50的匹配结果，再运用MS search 2.2 检索，以保留指数、匹配度筛选结果。

2.5.3 化合物的药味归属 取各药味样品溶液测定，检索鉴定化合物，分析苏神合剂挥发性成分的来源药味，验证化合物筛选结果。

2.5.4 对照品的确认 选取部分主要化合物对照品进行测定，确认化合物鉴定结果。

2.6 成分分析结果

取本品（批号：210103）按“2.1”项方法制备样品提取溶液，取各药味按“2.2”项方法制备各药味挥发性成分提取溶液，取“2.3”项下制备的对照品溶液，分别按“2.4”项方法测定，按“2.5”项方法进行苏神合剂挥发性成分鉴别和药味归属分析，采用峰面积归一化法计算成分相对质量分数，结果见图1－2、表1。

表1 苏神合剂挥发性成分分析结果Table 1 Analysis results of volatile components in Sushen mixture

图1 苏神合剂样品溶液和各药味提取溶液总离子流图Figure 1 TIC of Sushen mixture sample and ingredient samples

图2 对照品对照总离子流图Figure 2 TIC of reference substance confirmation

通过仪器工作站软件共分离出177 个化合物，经进一步筛选确认，共鉴定出29 种挥发性成分，相对质量分数占总量（按峰面积归一化计算）的90.56%，其中桉油精为49.74%、β-石竹烯为11.92%、柠檬烯为9.92%，是样品中含量最高的3 个化合物，并均以对照品确认。

2.7 多批样品挥发性成分分析

取其余9 个批次样品，参照“2.6”项方法以水蒸气蒸馏法提取、检测并分析成分，结果见表2。可见，10 批样品含有22 个共有成分，桉油精为各批样品质量分数最高的化合物。

表2 各批苏神合剂挥发性成分分析结果Table 2 Analysis results of volatile components in different batches of Sushen mixture

3 讨论

3.1 GC-MS结合保留指数法分析化合物

质谱数据库比对能够快速定性化合物，但对于同分异构体，如苏神合剂中的α-蒎烯与β-蒎烯、β-石竹烯与葎草烯（α-石竹烯）、α-松油烯与γ-松油烯等，谱图信息相似，难以准确匹配。此外，本品为合剂，药味多，成分复杂，干扰较大，不利于谱图比对。保留指数法是气相色谱经典的化合物定性方法，通过保留指数进行定性，结合质谱信息，有利于提高化合物鉴定的准确性[14-16]。本研究中，各化合物实测IR与数据库IR相差均不超过5，且部分化合物通过对照品确认，准确性较高。

3.2 化合物成分来源药味归属

苏神合剂中紫苏叶、陈皮、豆蔻、苍术，是本制剂挥发性成分的主要来源。鉴定的29 种化合物确认归属为紫苏叶、陈皮、豆蔻、苍术的分别为15 种、17 种、17 种和14 种，其中β-石竹烯主要来源于紫苏叶、柠檬烯主要来源于陈皮、桉油精主要来源于豆蔻，是苏神合剂最主要的挥发性成分。紫苏醛、紫苏烯为紫苏叶挥发油的特征成分，但工作站软件未鉴定出该两种化合物，经对照品确认，样品中未检出紫苏烯，而紫苏醛含量低，质谱图受干扰，难以通过谱图匹配。依《中国药典》2020 年版一部，豆蔻仁含桉油精不得少于3.0 %，紫苏叶应检出紫苏醛薄层色谱斑点，关于β-石竹烯、紫苏烯、柠檬烯等对应品种项下未作规定。本品原料符合质量标准，但未对相关成分进行考察和控制，可能导致了各批样品中成分含量存在差异，拟提高原料内控标准以更好地控制本品质量。

3.3 不同提取方法的比较

本研究比较了水蒸气蒸馏（SD）、乙醚萃取（DE）、环己烷萃取（CE）、乙酸乙酯萃取（EE）、顶空加热溶剂萃取（HS）等不同样品提取方法，其中水蒸气蒸馏提取法样品鉴定的29 种化合物，质谱响应高、干扰少；乙醚萃取、环己烷萃取、乙酸乙酯萃取的样品分别鉴定出18、20、18种化合物；顶空加热溶剂萃取法因进样方法受样品量（顶空瓶体积）和样品基质（水）限制，样品中仅桉油精峰质谱响应明显，故选择水蒸气蒸馏法提取苏神合剂挥发性成分，见图3－4。

图3 不同方法提取苏神合剂挥发性成分样品总离子流图Figure 3 TIC of Sushen mixture samples processed by different methods

图4 不同提取方法质谱总峰面积对比图Figure 4 Comparison of mass spectra total peak area of samples processed by different methods

本研究通过GC-MS 结合保留指数方法进行化合物鉴别，为苏神合剂针对其挥发性成分的质量标准提高、制剂工艺优化筛选指标成分、制剂稳定性考察提供参考，也为进一步研究苏神合剂药效物质基础提供依据。同时本研究还进行了成分药味归属分析，对于制剂药材原料质量控制和深入研究苏神方组方具有一定指导意义。