色谱及质谱检测技术在食品真菌毒素检测中的应用研究

黄志强

（钟祥市公共检验检测中心，湖北钟祥 431900）

真菌毒素是由真菌产生的具有毒性的次级代谢产物，其通常会影响食品或饲料的品质和安全性，因此对人们的健康有一定的影响。同时，真菌毒素也是食品、农产品、药用植物及其制剂的重要污染源之一[1]。目前，已经发现了400 种以上的真菌毒素，其中有200 多种产毒丝状真菌，如曲霉属、镰刀菌属和青霉属[2]。黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的一种毒素，含有B1、G1等羟基化代谢物，其中B1在粮食污染中较为常见，且其致癌性与毒性最强，容易导致肝癌。因此，黄曲霉素B1可作为食品安全性检验的一个重要指标。赭曲霉毒素是由鲜绿青霉、赭曲霉等代谢产生[3]，其中以赭曲霉毒素A的毒性最强，容易导致肠炎、肾病，甚至会诱发肾脏癌变。伏马毒素是由串珠镰刀菌等霉菌代谢所产生的一类真菌霉毒素，其中以伏马毒素B 的毒性最强[4]。单端孢霉烯族化合物是由头孢菌、镰孢菌等代谢产生的有毒代谢物[5]。玉米赤霉烯酮是一种从禾谷镰孢和其他镰刀菌属真菌中分解出来的次生产物，虽然毒性不强，但仍会对哺乳类动物产生一定的致病性。在适宜的环境下，真菌毒素会侵染农作物，对人与畜的健康造成了极大的威胁[6-7]。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种基于传统色谱的分离分析方法，可同时实现真菌毒素的定性与定量测定。然而传统的HPLC 在抗干扰能力、通用性方面上的表现较差，因此液相色谱质谱联用技术（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）技术得到了飞速发展。本文对食品中真菌毒素的检测方法进行了深入分析，旨在为食品中真菌毒素的安全风险评价监测提供理论与技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

LC-20AT 型高效液相色谱仪，日本SHIMADZU公司；API 4000 Q Trap 质谱仪，配电喷雾离子源（ESI）：美国ABI 公司；振荡器，上海康华生化仪器制造有限公司；高速离心机，美国BECKMAN公司；N-EVAP 水浴氮吹仪，美国OA 公司；Milli-Q 超纯水器，美国Millipore 公司。

1.2 试剂与材料

黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）标准储备液、呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON）标准储备液、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）标准储备液、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）标准储备液、伏马毒素B1（Fumonisin B1，FB1）标准储备液、伏马毒素B2（Fumonisin B2，FB2）标准储备液；甲酸﹑乙酸、甲醇和乙腈等均为色谱纯；氯化钠、氯化钾﹑磷酸二氢钾和磷酸氢二钠等均为分析纯；What-man 934-AH 玻璃微纤维滤纸；6 种毒素复合免疫亲和柱。

1.3 方法

1.3.1 分析条件

（1）色谱条件。流动相A（甲醇）、流动相B（将1 nL 甲酸和0.0 771 g 的醋酸铵加水溶解后置于1 000 mL 的容量瓶中，并加入高纯水定容至刻度线即得）[8]；色谱柱为C18（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）；柱温：40 ℃；进样量：4 µL；流速0.3 mL·min-1。

（2）质谱条件。离子源采用电喷雾离子源，其具有独特的离子碰撞反应，可以有效进行元素分析。质谱扫描方式采用多重反应监测模式，通过多个不同的反应来监测物质的存在，可以实现多元素的检测和分析。

1.3.2 样品提取

粮食中多组分真菌毒素的萃取溶液主要为甲醇和乙腈等有机溶剂与水的混合溶液[7]。实验将两种谷物混匀，使其粒度小于2 mm，选择V乙腈∶V水∶V甲醇=80 ∶19 ∶1 的混合液作为提取液。称取两个25 g 的粮食样品，加入100 mL 的萃取剂。在10 000 r·min-1以上的速度下快速均匀2 min，或在200 ～300 r·min-1的摇床上猛烈振动30 min。然后以4 000 r·min-1的速度离心5 min，将试样的上清液放进洁净的容器中。分别向离心后的残渣中加入100 mL 的V水∶V甲醇=20 ∶80 的混合溶液，再次进行振荡操作。再以4 000 r·min-1的速度离心5 min，将残余物的上清移到上述的干净的容器内，混合摇匀为上清液。称取8 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4，以及1.16 g Na2HPO4·12H2O，用800 mL 的超纯水溶解后，将其溶液定容到1 L，作为稀释液。此外，取混合均匀的上清液10 mL加入70 mL稀释液，混合均匀，再用微型滤纸滤取后，即可获得提取物。

1.3.3 提取液净化

为了降低探测过程中的干扰，提高实验检测的准确度。在提取待测样本前需要进行净化处理。改进型固相萃取法的原理与固相萃取法相似，主要方法包括免疫亲和柱（Immunoaffinity Chromatography，ICA）与多功能净化柱（Multifunctional Column Cleanup，MFC）。ICA 又被称为免疫亲和色谱法，其利用抗原-抗体反应，有选择性地将被测物从复杂的环境中分离出来，再将抗体与不溶解的固体高分子进行共价结合，填充到色谱上[8]。此次实验利用免疫亲和色谱法对样品进行纯化，取提取液32 mL 上样。复合免疫亲和柱中液体排干后，上样2 mL 洗脱剂，静置3 min。然后以每秒1 滴的速度进行洗脱，并将其置于5 mL的离心试管中，待洗脱液在复合免疫亲和柱中放净后，取1 mL 的洗脱放液，静置3 min。再以每秒1 滴的速度进行洗脱，并将收集到的洗脱液置于5 mL 的离心管中。按照V乙酸∶V甲醇=2 ∶98 的混合溶液进行两次洗脱。将所采集的洗提物在50 ℃用氮气进行干燥处理，并用1 mL 50%甲醇进行定容，即可获得待测液。

2 结果与分析

此次实验采用色谱及质谱检测技术对粮食承储企业稻谷的真菌毒素进行检测。先对样品进行预处理，用微纤维滤纸过滤，得到提取液。然后用复合免疫亲和柱对其进行净化处理，获得待测液。最后以50%甲醇为溶剂制备6 种不同的混合标准液。如图1所示，为6种真菌毒素的质谱多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）色谱图。

图1 6 种真菌毒素MRM 色谱图

由图1 可知，脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A 和伏马毒素B2这6 种真菌毒素的色谱峰峰形尖锐，分离度好，适合进行定性定量。根据6 种真菌毒素在质谱MRM 模式下的响应强度，配制出不同浓度的混合标准溶液。按照样品前处理方法处理后，再进行测定分析。

由表1 可知，脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏马毒素B2这6 种真菌毒素的检出限为0.5 ～50.0 μg·kg-1。取粮食承储企业稻谷的空白粮食样品，分别添加表1 中不同浓度的6 种真菌毒素混合标准溶液，按照样品处理步骤进行操作，得到的平均回收率与相对偏差值结果如表2 所示。

表1 6 种真菌毒素的检出限

表2 6 种真菌毒素平均回收率与相对偏差值结算结果

由表2 可知，此次实验检测的粮食样品中6种真菌毒素加标量在2 ～800 μg·kg-1时，平均回收率为75.5%～102.5%，批内的相对标准偏差为3.7%～9.7%。实验结果表明，研究采用色谱及质谱检测技术测得粮食承储企业稻谷的毒素结果满足食品理化检测要求。

3 结论与讨论

为了检测食品中的真菌毒素和代谢物的污染情况，对真菌毒素的检测流程以及各项操作步骤进行分析，提出使用色谱及质谱检测技术对粮食承储企业稻谷的真菌毒素进行检测。结果表明，AFB1、DON、ZEN、OTA、FB1和FB2这6 种真菌毒素的色谱峰峰形尖锐，分离度好，适合进行定性定量分析，其检出限在0.5 ～50.0 μg·kg-1。6 种真菌毒素加标量在2 ～800 μg·kg-1时，其平均回收率在75.5%～102.5%，批内的相对标准偏差为3.7%～9.7%。这表明研究采用色谱及质谱检测技术满足食品理化检测要求。