人参的组织培养研究进展

荆 礼，袁欣月，张 巍，齐 滨*

（1.长春中医药大学创新实践中心，长春 130117；2.长春中医药大学药学院，长春 130117；3.长春中医药大学东北亚中医药研究院，长春 130117）

人参[1]为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎，具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智的功效，被称为“百草之王”。现代研究表明[2]，人参中含有皂苷类、糖类、挥发性成分、有机酸及其酯、蛋白质、酶类等多种化学成分，在抗肿瘤、抗衰老、降血糖、提升免疫力等多方面发挥显著作用。

人参多分布于我国辽宁东部、吉林东半部和黑龙江东部。传统的人参药材获取方法以采集和消耗大量的野生植物资源为代价，当采集和消耗量超过自然资源的再生能力时，必然会导致其物种濒危甚至灭绝[3]。《国家重点保护野生药材物种名录》 将人参列为二级保护野生药材物种。随着社会的发展，人参的市场需求日益增加，为了解决人参药材的供需矛盾，人们多采用人工栽培的方法扩大药源。栽培的人参俗称“园参”，播种在山林野生状态下自然生长的称“林下山参”，习称“籽海”。但人工栽培人参生长周期较长，受气候、环境、栽培条件以及病虫害影响较大，常发生红皮病、根腐病及锈腐病等，而且大田栽培往往使用大量的农药，造成严重的农药残留和重金属残留问题[4]。药用植物的组织培养是解决这些问题的有效途径。植物组织培养[5]是指在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质体)，培养在人工配制的培养基上，通过适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽或完整的植株。其依据的是植物细胞的“全能性”及植物的“再生作用”[6]，具有不受土地、季节和环境条件等限制，生长迅速，周期短等优势。利用组织培养，不仅可以生产大量的优良无性系植物，还可获得人类需要的多种代谢物质。本文对近年人参植物组织培养方法加以综述，为今后的相关研究提供参考。

1 人参愈伤组织诱导

愈伤组织（callus）是指原植物体受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。罗士韦[7]等人于1964 年首次使用改良的Heller 氏培养基及人参鲜根，成功培养人参愈伤组织。迄今为止，人参属植物体各个部位，如茎尖、茎段、皮层、花瓣、子叶等，都能成功诱导出愈伤组织[8]。安利佳等人[9]以人参花药为原材料，成功诱导得到人参愈伤组织，王建华[10]使用人参芽苞及10 日龄实生苗的根、茎、叶诱导得到愈伤组织，诱导率较高，岳才军[11]等人诱导人参种胚得到愈伤组织。

任跃英等人[12]研究了不同光质对人参愈伤组织生长及皂苷含量的影响，结果表明，绿光加速人参愈伤组织老化，促进次生代谢产物的积累；蓝光对人参愈伤组织生长有促进作用；红光和绿光对总皂苷作用不明显；蓝光、红蓝光（1∶1）、黄绿光（1∶1）对人参皂苷转化与合成起到明显的抑制作用。同时，一些诱导因子，如酵母提取物、各种病原菌、重金属盐类、紫外线等，能作为一种特定的信号，诱导细胞中目的基因的表达，从而调节植物细胞中次生代谢产物的合成[13]。王建华等人[14]经直观分析、方差分析与多重比较，确定人参愈伤组织诱导的最优培养基为MS＋2,4-D（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸）3 mg·L－1＋BA（Benzylaminopurine，苄氨基腺嘌呤）0.5 mg·L－1＋NAA（1-Naphthylacetic acid，萘乙酸）0.5 mg·L－1＋KT（kinetin，激动素）0.5 mg·L－1；人参愈伤组织生长的最优培养基为MS＋2,4-D 3 mg·L－1＋KT 1 mg·L－1。齐海军等人[15]研究表明，当KT 为1 mg·L-1、NAA 为0.66 mg·L-1、2,4-D 为2 mg·L-1、6-BA（N-(Phenylmethyl)-9Hpurin-6-amine，6-苄氨基嘌呤）为0 mg·L-1时，愈伤组织诱导率及单个外植体上的愈伤组织小块数达到最大值，分别为94 %和1.9。

2 人参细胞悬浮培养

植物细胞悬浮培养[16]是指植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养基中，用摇床或转床进行培养。植物细胞悬浮体系由于其分散性好、细胞形状及细胞团大小基本相同，增殖速度快、重复性好、培养规模大、易于控制等优势，被广泛应用于生理学、细胞学、生物化学、发育生物学、遗传学及分子生物学的研究[8、16]。选择半透明、黄色、质地松散均一的愈伤组织建立悬浮培养，其分散程度好、单细胞多、细胞分裂旺盛[17]。悬浮细胞的生长曲线基本呈“S”形，最佳培养周期为30天[18-19]。吴春霞等人[16]认为在继代培养过程中，初始接种量以40mL 的液体培养基加入1.5 g 左右的培养物为宜。李铁军等人[20]认为悬浮培养人参细胞的最佳接种量为鲜重6g。

在植物细胞培养过程中，培养基中碳源、氮源、磷酸盐、激素及摇床相关参数的水平直接影响次生代谢产物的积累。高日、张丹等人[18，21]研究表明，在培养基中添加30g·L-1蔗糖时，人参细胞干重和皂苷含量最高。有研究[21]认为，当培养基中总氮浓度为30mM 时，硝态氮含量高，有利于皂苷的合成，培养基中单独使用硝态氮（NO3＋／NH4－为30∶0）时，皂苷生产量最高，单独使用铵态氮（NO3＋／NH4－为0∶30）时，细胞几乎不生长。又有研究认为[18]，NO3＋、NH4－二者配合使用，鲜重增加量和皂苷积累量都较高，因此在皂苷合成中所需氮的形式不是单一的，既需要硝态氮也需要氨态氮，只有二者相互配合才能达到最佳效果。磷酸盐浓度为170mg·L-1时较为适合人参细胞的培养[18]。张丹等人[18]在单因素优化试验的基础上，进行正交设计L16（44），结果表明以鲜重为指标的最佳激素配比，2,4-D 3.0mg·L－1＋BA 0.2mg·L－1＋NAA 2.0mg·L－1＋KT 0.4mg·L－1；以皂苷产量为指标的最佳激素配比为：2,4-D 2.0mg·L－1＋BA 0.4mg·L－1＋NAA2.0mg·L－1。以鲜重增加量为指标，摇床相关参数的最佳培养条件：接种量为10g/瓶、装液量为100mL、摇床转速为80r/min、温度为21℃。以皂苷产量为指标的最佳培养条件：接种量为10g/瓶、装液量为120mL、摇床转速为100r/min、温度为19 ℃。此外，李铁军等人[20]在进行细胞培养时，调查了培养瓶瓶盖换气滤膜的有无对细胞生物量及皂苷积累的影响，结果表明，使用有滤膜的瓶盖有利于细胞生长和皂苷的合成。

3 人参毛状根培养

毛状根是发根农杆菌侵染植物后产生的一种病理状态。发根农杆菌Ri 质粒的T-DNA 可以整合到植物基因组DNA 中并成功表达，诱导生成毛状根，最终建立毛状根培养系统。由于毛状根具有在无激素的培养基上快速生长，拥有亲本植物的次生代谢途径，遗传稳定，生长迅速等特点[8]，且发根农杆菌及其Ri 质粒转化产生的毛状根比较容易再生出新植株，因此，人参毛状根的培养是利用生物技术生产次生代谢产物新的有效途径，适用于有价值的次生代谢产物的生产[22]。

周倩耘等人[23]研究表明，IAA（3-Indoleacetic acid，3-吲哚乙酸）、IBA（3-Indole butyric acid，3-吲哚丁酸）、2,4-D 及6-BA 四种生长素能促进人参毛状根生长以及总皂苷的积累，同时能影响单体皂苷的分布，其中0.005 mg·L－1IBA 是促进人参毛状根生长以及皂苷积累的最佳浓度。刘俊等人[24]研究发现黑曲霉诱导因子在培养液中浓度为20mg·L－1时对总皂苷合成呈促进作用，并在20～400mg·L－1促进人参毛状根的生长。Peak 等人[25]研究表明，Cu 胁迫有助于提高人参悬浮培养中人参皂苷的含量。

4 人参不定根培养

植物非根组织（如嫩茎，枝条，地上茎、地下茎等）上形成的根为不定根[26]。不定根的发生是由于植物器官受伤或植物激素等外界刺激，通过植物的茎、叶、节、愈伤组织诱导而产生[27]。其培养具有生长周期短、条件可控、误差小、材料来源单一、遗传背景一致、经济方便、重复性强、效率高和可周年试验或生长等优点。黄韬等人[28]研究发现，人参不定根接种量为20g·L－1时，其生长状态最好，干重增值倍数最大；蔗糖质量浓度为40 g·L－1时，多糖产量和皂苷产量均达到最大值。黄韬与Sivakumar G[29]等人同时认为，3/4 MS 培养基最有利于人参不定根的生长，并且较低的无机盐浓度有利于人参皂苷的合成和积累。潘兆喜研究表明[30]，当IBA 浓度为4 g·L－1时，不定根的鲜重和皂苷含量达到最大值。Peak 等人[25]研究表明，MS 培养基中NH4-/ NO3+（mM）为7.19∶18.5 时，最适合不定根的生长及人参皂苷的积累。

5 展望

人参作为传统名贵中药材，应用价值极高。丁家宜教授以人参细胞为原料，从天然人参植株中成功培育出“人参活性细胞（AGCA）”，研发出丁家宜美白系列产品，是我国药用植物组织培养开发产品方面的成功案例。但人参生长周期较长，且受气候、环境、栽培条件以及病虫害影响较大，这些给人参种植业带来很多不便。组织培养技术不仅可以克服这些弊端，还是植物快速繁殖的最佳途径。通过对人参组织培养的研究，既可以实现人参的快速繁殖，又可以提高人参主要药用成分的含量，对中医药事业的长远发展和环境保护具有重要的意义。