间充质干细胞及其衍生外泌体治疗ARDS进展

黑飞龙

（首都医科大学附属北京安贞医院体外循环及机械辅助科，北京 100029）

1 前言

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome， ARDS）是由多种肺内和肺外因素引起的弥漫性肺损伤，最常见的原因为肺炎、胃内容物吸入和脓毒血症［1］。ARDS的发病机制涉及免疫反应失衡、炎症诱导的肺泡内皮∕上皮屏障的破坏、凝血激活及成纤维细胞的增殖等［2］。尽管在支持性治疗方面已经取得了巨大进展，但中重度ARDS患者的死亡率仍然高达30%~40%［3］，且幸存者往往伴随多种并发症，如认知功能障碍、肌肉萎缩和虚弱等，严重降低患者生存质量，增加医疗花费及社会负担［4-5］。此前，有多种药物在临床前研究中取得了良好的治疗效果，包括β-受体激动剂、吸入一氧化氮（nitric oxide， NO）、他汀类和活化蛋白C等，但临床转化结局均以失败告终［6］。因此探寻ARDS的有效治疗药物是临床上亟待解决的重大问题。间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSC）及其衍生的外泌体（mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-Exos）因其强大的免疫调节和组织再生等特性引起大家的广泛关注。在ARDS的动物模型中，MSC及其外泌体表现出优异的治疗效果。基于MSC治疗中重度ARDS的Ⅰ期和Ⅱ期临床试验显示出静脉注射MSC初步的安全性结果［7-8］。2019冠状病毒病（corona virus disease in 2019，COVID-19）是由严重急性呼吸窘迫综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARSCoV-2）引起的传染病，严重者可发展为ARDS。早期初步的临床试验证明了MSC在COVID-19患者中的有效性和安全性［9］。

本文旨在对MSC及其衍生外泌体的特性，治疗ARDS的作用机制及临床试验进展做一概述。

2 间充质干细及其衍生外泌体概述

2.1 间充质干细胞

Friedenstein等［10］在1970年首次将MSC描述为存在于啮齿动物骨髓间质中的“集落形成单位成纤维细胞”。骨髓间充质干细胞（bone marrow MSC，BM-MSC）是研究最为广泛的MSC。MSC来源丰富，几十年来相继在其他组织的间质中发现了MSC，如脂肪组织、脐带、沃顿胶、子宫、胎盘、羊水、肺、软骨滑膜液、扁桃体、真皮、骨骼肌、骨膜、牙髓或外周血等［11］。骨髓间充质干细胞在标准培养基中呈现成纤维细胞样的梭形。国际细胞治疗学会在2006年为MSC的定义制定了如下通用标准：① MSC必须具备塑料黏附能力；② 同时表达基质标志物（CD29、CD44、CD73、CD90和CD105）而缺乏造血细胞（CD45和CD14）或内皮细胞标志物（CD31和CD34）；③ 体外成骨、成脂和成软骨分化潜能［12］。

MSC通过其抗菌作用、强大的抗炎特性和控制细胞增殖、凋亡、血管生成或氧化应激等能力调节组织稳态。这些作用可能是MSC通过分泌可溶性生物活性分子或外泌体影响组织微环境实现的［13］。MSC作为有前景的细胞治疗方式的另一特性是它们的“归巢”效应，是指MSC在机体受损时自发迁移到损伤区域的能力［14］。体内研究中已经证实MSC移植可以归巢至受损区域。体外研究表明受损组织趋化因子的表达刺激了MSC的迁移。这些信号分子包括TNF-α［15］、PDGFα［16］、IGF-1［17］、HGF和EGF［18］，以及MSC上表达的趋化因子（CXCL1、4、6、7、9、10及12）的受体［19］。此外，MSC分泌的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteases， MMP），如MMP-1（也称为间质胶原酶）可以降解基质成分从而允许MSC穿过内皮基底膜［13］。

2.2 MSC衍生外泌体

MSC的治疗作用主要归因于其靶向迁移到损伤部位并分化成为不同的细胞类型从而促进组织再生。然而，一些研究发现MSC移植在体内的存活时间太短，因此无法产生有效的治疗作用。事实上，据报道［20］<1%的MSC在全身给药之后可存活一周以上，但通常认为它们对新生组织生成的贡献是非常轻微的。越来越多的证据表明MSC的有益作用主要是通过其分泌的可溶性旁分泌因子介导的。MSC衍生的外泌体在MSC响应外界刺激和维持组织稳态中起着至关重要的作用［21］。外泌体是直径为40~160 nm的胞外囊泡，具有脂质双分子层结构，在细胞间通讯中发挥重要作用。外泌体通过将其内含有的多种内容物（蛋白质、脂质、核酸、细胞因子，甚至来自于分泌细胞的细胞器等）转移至受体细胞中改变细胞的病理或生理状态从而维持机体的稳态［22］。MSC来源的外泌体具有与MSC相似的抗炎和组织修复作用［21］。实验研究揭示了外泌体在一系列疾病中的治疗作用。既往研究［23］表明，通过吸入或静脉内给予MSC来源的外泌体在ARDS的治疗方面与应用MSC同样有效，其可通过减少内毒素肺损伤后炎性细胞的浸润和恢复肺泡-毛细血管通透性而减轻炎症和肺泡水肿。相比于直接应用干细胞治疗，这一无细胞治疗方式显示出巨大的优势，包括：① 体积小，免疫原性低；② 与移植增殖的活细胞相关的并发症得到解决，包括致瘤性、栓子形成、感染传播和MSC衰老；③ 与细胞治疗相比，外泌体在安全性、剂量和效能方面可以更好地进行评估；④ 易于储存；⑤ 在血液循环中半衰期更长；⑥ 对炎症和肿瘤部位的趋向性；⑦ 易于穿透生物屏障等［24］。当然，外泌体治疗也存在潜在的风险，主要是与外源性生物制品的使用有关，但这一风险与细胞治疗相比似乎更小。

3 MSC及其衍生外泌体治疗ARDS的作用机制

3.1 抗微生物

MSC表达的干扰素刺激基因（interferonstimulated genes， ISG）如CCL2、IFI6、ISG15、PMAIP1、SAT1和p21∕CDKN1A等可以抵抗病毒感染，如登革热病毒、埃博拉病毒、甲型流感病毒等［25］。另外，来自MSC的可溶性蛋白，如IL-10、PGE2和TNF-α对微生物也具有抵抗作用［26］。MSC还可以直接通过分泌抗菌肽发挥微生物抑制作用，已经发现的抗菌肽包括抗生素、防御素、胱抑素C、弹性蛋白酶抑制因子和脂钙蛋白2。这些抗菌肽都是进化学上保守的小分子量蛋白质，大小为10~150个氨基酸残基不等，通过抑制DNA或RNA合成并与某些细胞内靶点相互作用来介导抗菌作用［27］。抗菌肽的切割产物LL-37具有对抗革兰阴性菌和革兰阳性菌的广谱抗菌活性。LL-37在功能上也依赖于TLR调节，TLR触发MSC激活炎性NF-κB通路和干扰素调节因子的表达，这是抗病毒感染的基础［28］。MSC通过TLR4识别微生物分子后分泌的趋化因子（CCL3、CCL4、CCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11）及IL-6、MIF、GM-CSF等可以促进中性粒细胞和单核细胞的募集［29］。

3.2 免疫调节

研究［30］指出在炎症微环境下，MSC被激活并分泌高水平的可溶性抗炎因子，如COX2、IDO、NO、TGF-β1、PGE2和HLA-G5。在实验性ALI模型中，这些抗炎因子能够通过减轻肺水肿、维持肺泡-内皮屏障的稳态而发挥肺保护作用［31］。MSC对所有的免疫细胞类型都有免疫调节作用，包括抑制T细胞增殖，抑制B细胞、自然杀伤细胞以及树突状细胞功能和极化，使巨噬细胞重编程为产生IL-10的抗炎表型［13］。MSC-Exos可通过传递miRNA减少肺内中性粒细胞和巨噬细胞浸润，从而减轻肺损伤［32］。TLR4信号通路在炎症反应中起着关键作用。过表达miR-451的MSC-Exos抑制TLR4及其下游靶蛋白（NF-κB∕P65和p-P65），增加肺组织内丙二醛、骨髓过氧化物酶和过氧化物歧化酶的水平，并降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平［33］。MSC-Exos中功能性线粒体的转移通过增强氧化磷酸化导致巨噬细胞从促炎表型向抗炎表型极化［34］。

3.3 组织再生

组织再生包括迁移、抗炎∕免疫调节、加速再上皮化、改善胞外基质的产生和重塑等一系列过程。由MSC分泌的负责这一机制的分子有炎症因子（IL-1、IL-6、CXCL8、IL-13、PGE2、CCL2）、生长因子（EGF、KGF、TGF-β、HGF、VEGF、GF-1、PDGF、BNDF、NGF-3、IG-CSF、GM-CSF）和ECM蛋白（MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、TIPM-1y2、ICAM、胶原、层粘连蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖）等［11］。此外，血管生成的增加被认为是MSC通过其旁分泌作用发挥组织再生作用的另一个重要机制。MSC可以分泌促进内皮细胞增殖和迁移的分子，如VEGF、PDGF、ANG1y2、EGF、FGF、TGF-β1、TGF-α、CCL2、CXCL5和MMP等［13］。

3.4 抗纤维化作用

在ARDS的病理过程中纤维化逐步发展，这是由于细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白，如纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的过度沉积所造成的，最终使得肺组织不能发挥其再生能力来承担其气体交换功能［35］。来自于动物ARDS模型的研究结果证实MSC可通过分泌可溶性分子如MMP-1、HGF、TGF-β3、TNF-α、IL-10、VEGF和HGF发挥抗纤维化作用［13］。

3.5 抗凋亡作用

细胞凋亡是一种程序性死亡模式，是一个动态的过程，严格控制细胞分裂和死亡的速度，特征包括DNA降解、核膜肿胀、胞质收缩，最终引起细胞死亡。研究［36］表明MSC需要通过上调Ki-67增殖指数以及抗凋亡标志物Bcl2和survivin，并通过下调凋亡标志物annexin V，caspase-3和caspase-9来抑制细胞凋亡。免疫细胞的凋亡还有助于ARDS的进展。研究发现在ARDS模型中全身给予MSC可以减少肺组织和远隔器官的凋亡细胞数量。据报道，MSC可以通过分泌KGF，HGF和ANG-1减少肺组织内不同细胞类型的凋亡，如肺泡上皮和内皮细胞，还可以减少脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肺泡巨噬细胞的凋亡，这一作用部分是通过抑制Wnt∕β- catenin通路实现的［37］。血清淀粉样蛋白A3（serum amyloid A3， SAA3）在急性肺损伤（acute lung injury，ALI）时高表达。Yi等［38］将过表达miR-30b-3p的MSC-Exos注射到LPS诱导的ALI小鼠体内，发现miR-30b-3p可以降低肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells， AEC）SAA3的表达，最终促进AEC的增殖，抑制AEC凋亡从而减轻ALI。同样，过表达miR-21-5p的MSC-Exos通过靶向PTEN和PDCD4等促凋亡基因，抑制小鼠肺内皮细胞的内源性和外源性凋亡通路，减少肺细胞凋亡，改善肺损伤［39］。

3.6 其他

MSC对ARDS治疗作用的其他机制包括预防肺损伤背景下的肺泡上皮细胞的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、抗氧化和改善肺泡液体清除。尽管每个细胞内都存在应激反应，但病理状态取决于自由基和抗氧化剂之间平衡的破坏程度。细胞中活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）水平的增加可以通过氧化DNA、蛋白质和脂质以及启动细胞应激途径而造成损伤。受损的细胞会破坏ECM，促进炎症介质的释放，加之低氧环境和营养物质的缺乏在受损区域创造了一个有害的微环境。MSC表达的热激蛋白70（heatshock protein 70， HSP70）和去乙酰化酶（sirtuin，SIRT）有助于抵抗氧化应激损害［40］。另外，MSC也可通过其他多种机制应对氧化应激，包括直接清除自由基，增强内源性抗氧化防御机制，通过抑制活性氧自由基进行免疫调节，改变线粒体生物能量产生以及向受损细胞提供功能性线粒体等［41］。

肺泡和肺间质内过量的液体积聚会降低肺表面活性剂的浓度并损害肺的气体交换功能。因此清除肺内渗出的水肿液有助于ARDS患者肺功能的恢复。有研究［42］表明MSC可通过分泌旁分泌因子如ANG-1和FGF-7（或KGF）促进肺泡内液体的清除。这些生长因子介导钠通道转运至上皮细胞顶端膜，从而使肺泡液的清除恢复正常。这一作用在ARDS的动物模型和被内毒素或E. coli损伤的体外灌注人肺模型中都得到证实。Park等［43］利用体外灌注人肺模型进行的研究发现给予MSC-Exos可使肺蛋白通透性显著降低，肺泡液体清除率增加，而肺顺应性和PaO2没有显著改善。此外，只有Poly （I：C）预处理的MSC-Exos才能观察到细菌负荷的减少［32］。

4 MSC及其衍生外泌体的功能优化

近年来已经开发出多种方法来提高MSC的部位靶向性以减少达到治疗效果所需要的MSC的数量，这些方法包括基因操作、在目标部位直接注射MSC、细胞表面改造以及体外预处理等。与此同时，MSC由于其固有的归巢能力，可通过负载某些药物提高其治疗效果［44］。MSC-Exos由于其特殊的结构可作为一种天然的药物递送纳米载体。此外，用于外泌体表面修饰的几种方法也使它们成为一种有效的靶向特异性药物递送系统，这些方法包括基因工程修饰、共价修饰和非共价修饰，而其中使用质粒对外泌体分泌细胞进行基因工程改造是产生表面修饰外泌体的广泛使用的方法［45］。除此之外，应用外泌体治疗COVID-19的优化策略还包括筛选和负载一系列能够特异性结合冠状病毒基因组的miRNA至外泌体中破坏病毒结构，将MSC来源外泌体的治疗特性和抗病毒药物治疗作用结合起来［46］。

5 MSC及其衍生外泌体治疗ARDS临床试验进展

迄今为止，已经有超过1 000项临床试验正在进行以评估MSC及其衍生外泌体的治疗潜力。MSC治疗的安全性和有效性已经在多种疾病的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期临床试验中得到证实，包括自身免疫和炎症性疾病、同种异体移植排斥反应、心肌梗死、脊髓损伤、骨骼疾病、退行性疾病、广泛性烧伤、严重的慢性伤口和严重肺炎［47］。在Ⅰ期和Ⅱ期临床试验中已经得出了MSC对几种肺部疾病治疗的初步安全性结果。MSC治疗ARDS的第一项临床试验是在中国进行的，这是一项Ⅰ期、单中心、随机、双盲、安慰剂对照临床试验，ARDS患者对单次静脉注射同种异体脂肪组织来源的MSC（AT-MSC）（1×106cells∕kg）耐受性良好且无输注相关不良反应［48］。在美国进行的第二项多中心、开放标签和剂量递增的Ⅰ期临床试验中，中重度ARDS患者接受单次静脉注射异体BM-MSC（1×106cells∕kg， 5×106cells∕kg 和10×106cells∕kg），结果显示所有患者耐受性良好［7］。在接下来进行的Ⅱ a期临床试验中，患者接受高剂量（10×106cells∕kg）的BM-MSC，没有观察到呼吸相关不良反应且氧合指数提高，血浆中的ANG-2水平降低，表明给予MSC可减轻内皮损伤［8］。然而，MSC治疗ARDS也存在一些问题。有报道称接受MSC治疗的ARDS患者死亡率更高，但可能是由于该治疗组患者的疾病更为严重［8］。此外，研究发现应用MSC治疗的患者短期肺功能评估没有显著变化［49］。旨在进一步评估MSC衍生外泌体治疗ARDS安全性和有效性的临床试验目前正在进行中（NCT04602104、NCT05354141、NCT05387278、NCT04798716、NCT04493242、NCT0 4747574）。

6 总结和展望

ARDS由于其发病率高、死亡率居高不下以及缺乏最佳药物治疗方法，仍然是当前医学面临的巨大挑战。临床前研究和早期临床试验已经证实了MSC及其衍生的外泌体在ARDS中的治疗价值。MSC及其衍生外泌体显示出抗微生物、免疫调节、组织再生、血管生成、抗纤维化、抗氧化应激和抗凋亡作用，可抑制ARDS发病机制的多个环节。使用MSC-Exos可以避免与MSC管理相关的安全问题，且可以通过不同剂型给药。MSC-Exos可以通过吸入或者静脉注射方式给予，在血液中保持稳定直至进入肺部发挥作用。然而，由于其特殊的分离方式及当前大规模生产的限制性，MSC-Exos的成本似乎要高于其他治疗方法。迄今为止，给药途径、注射率、细胞移植剂量、移植频率、细胞移植时间窗的选择等技术问题仍需解决，最佳的临床效果和安全性还无法保证。因此，还需要设计更大规模、多中心、长期随访的临床试验以证实MSC和MSC-Exos的有效性和安全性。此外，异质性对MSC的临床应用也有很大的影响，因此加强干细胞制剂的质量控制势在必行。解决以上局限性将加速MSC及其衍生外泌体的临床转化进程。