鸭坦布苏病毒的分离、鉴定及致病性研究

李群 丁国伟 窦莉莎 姜晓芳 范娟

摘 要：2022年5月，江苏扬州某鸭场25日龄左右樱桃谷鸭发生了以瘫痪为主要表现的神经症状疾病，病死鸭剖检无特征性病变。RT-PCR检测结果显示为鸭坦布苏病毒（Tembusuvirus，TMUV）感染。为了分离该病毒，将处理后的发病鸭组织样品经尿囊腔途径接种10日龄鸭胚，将分离到的病毒命名为YZ01株。遗传演化分析结果显示，该病毒与我国其它水禽源分离株具有相近的遗传演化关系，属于2.2分支。为评估该分离株的致病性，经脑内途径接种7日龄樱桃谷鸭，在接种后3d，雏鸭出现行动困难、震颤等症状，在感染后7d雏鸭死亡率达70%；结果显示，分离株YZ01株对雏鸭具有高致病性。攻毒保护试验结果显示，HB疫苗株对YZ01的攻毒保护率为80%。本研究为TMUV感染提供了流行病学依据。

关键词：鸭坦布苏病毒；分离；遗传进化分析；

中图分类号：S858.323文献标识码：B文章编号：1673-1085（2023）03-0006-06

鸭坦布苏病毒（tembusu virus， TMUV）病，主要危害产蛋期种鸭和蛋鸭，导致采食量和产蛋量大幅度下降[1-3]。2014年以来，我国研究者在樱桃谷商品肉鸭群和青年蛋鸭群陆续分离到鸭坦布苏病毒 [4-7]。TMUV不仅能在不同品种蛋鸭、肉种鸭和肉鸭群中传播流行，还可以感染其它禽类，如鹅、鸡、麻雀等[8-9]，且具有水平传播的特点，给该病防控带来巨大阻力。

TMUV是黄病毒科（Flavivirus）黄病毒属（Flavivir）的病毒，基因组为单链正链RNA，长10 990 kb，仅含一个开放阅读框（Open reading frame， ORF），编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白，囊膜蛋白（envelope， E）是主要的表面糖蛋白，能刺激机体产生中和抗体，在决定病毒嗜性、毒力和致病性方面亦发挥主要作用，同时也是 RT-PCR方法检测的重点[10-11]。

本试验从江苏省扬州某种鸭场送检的樱桃谷鸭样品中分离到1株TMUV（命名为YZ01株），对分离毒株的E基因进行了序列测定和致病性研究，为TMUV感染提供了流行病学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2022年5月，从江苏省扬州某鸭场25日龄左右的发病樱桃谷鸭群中，采集病鸭的心脏、肝脏、脾脏、肾脏和脑脏组织共计5份。

1.1.2 鸭胚和试验动物 无TMUV母源抗体的10日龄鸭胚和7日龄樱桃谷鸭，由扬州优邦生物药品有限公司动物实验中心提供。

1.1.3 主要试剂盒 Easy Pure? Viral DNA/RNA Kit、2×EasyTaq? PCR SuperMix、DL2000 DNA Marker以及TA载体均购自北京全式金公司；E.Z.N.A. Gel Extraction Kit购自Omega公司，M-MLV Recerse Transcriptase购自Promega公司。

1.1.4 引物 根据GenBank中TMUV PS株序列（GenBank登录号：KT876991）设计扩增E基因的全长引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：

E-f：5'-TTCAGCTGTCTGGGGATGCA-3'

E-r：5'- CAGGGTTTGAAGCTGAAAG-3'

1.2 方法

1.2.1 样品的处理 将发病鸭脾脏组织用剪刀剪碎后与无菌磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline， PBS）按照1：5（w/v）比例研磨，制成20%匀浆，随后5 000 r/min离心15 min，取上清液，经0.22 μm 滤器除菌，置-70 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 病毒的分离与鉴定 取上述滤液经尿囊腔途径接种10日龄鸭胚10个，每胚接种0.2 mL，37 ℃培养，弃去24 h内死亡的鸭胚。每天观察死胚情况，并及时收获死胚尿囊液。将未死鸭胚孵育至120 h收获尿囊液，置-70 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 RT-PCR检测 利用Easy Pure? Viral DNA/RNA Kit对上述样品进行总RNA提取，通过反转录获得cDNA。具体方法：取 RNA 5 μL与2 μL E-r引物混匀，70 ℃作用 10 min，冰浴2 min，加入5×MLV Buffer 5 ?L、M-MLV 1 ?L、dNTP（10 mM each）5 ?L、RRI 0.5 ?L，用超纯水补足至25 ?L，在42 ℃作用1 h，94 ℃作用5 min。

利用2×EasyTaq? PCR SuperMix进行PCR。反应体系如下：cDNA 5 ?L，上下游引物各2 ?L，2×EasyTaq? PCR SuperMix 25 ?L，用超純水补足至50 ?L，随后进行如下程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖核酸凝胶观察PCR产物。

1.2.4 目的片段的回收、连接与转化 切取目的片段，利用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit对目的片段进行回收和纯化。取胶回收产物4 ?L与1 ?L TA载体混合，在25 ℃作用30 min，转化到DH5α感受态细胞。次日，挑取单个菌落，将鉴定结果为阳性的菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.5 序列及遗传进化分析 从GenBank下载所用TMUV参考毒株序列（表1），使用MEGA 5.0绘制遗传进化树。

1.2.6 病毒的致病性试验 为评估分离株的致病性，用鸭胚扩繁F2代病毒。用鸭胚测定F2代尿囊液中的病毒含量。具体方法：将F2代尿囊液用无菌PBS进行10倍系列稀释（10-1～10-6），经尿囊腔途径接种10日龄鸭胚，按照0.1 mL/胚的剂量（同一稀释度接种5个胚）用石蜡密封接种孔，并置37 ℃孵化箱孵化。每日照胚2次，弃掉24 h死亡的鸭胚。连续观察5 d，记录每个稀释度死亡鸭胚数量，按Reed-Muench法计算病毒的半数感染量（egg infectious dose， EID50）。以104.0 ELD50经脑内感染7日龄樱桃谷鸭，对照组注射0.2 mL PBS。连续观察14 d，观察攻毒组鸭的临床表现，记录死亡率。TMUV参考毒株信息见表1。

1.2.7 攻毒保护试验 为评估当前TMUV疫苗株HB对分离株YZ01的免疫保护效果，取7日龄樱桃谷鸭20只，随机分为2组，每组10只。经颈部皮下接种0.5 mL TMUV灭活疫苗HB株，对照组接种等剂量的PBS。免疫后28 d，用YZ01株攻毒。攻毒后3 d，采集血液并分离血清。将血清无菌处理后，每个样品以0.2 mL的剂量接种3个10日龄的鸭胚，放置37 ℃孵化箱继续孵化7 d。每日照胚2次，弃掉24 h死亡的鸭胚，并记录死亡鸭胚数量。7 d后，收取尿囊液。提取RNA后，利用上述引物进行RT-PCR检测，以评估疫苗株HB对分离株YZ01的攻毒保护情况。

2 结果与分析

2.1 病毒分离鉴定

经尿囊腔途径接种脾脏组织过滤液，鸭胚在感染后4～5 d内全部死亡，死亡鸭胚胚体严重出血（图1）。收取死亡鸭胚的尿囊液，用RT-PCR进行TMUV E基因的检测，结果为阳性（图2）。因此，成功分离到TMUV毒株，命名为YZ01株。用鸭胚扩繁病毒至F2代，测定病毒滴度为104.4 ELD50/0.2 mL。对F2代病毒外源病毒的检测，未扩增出禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、鸭星状病毒（DAstV）、鸭肝炎病毒（DHAV-1和3型）等外源病毒的特异性条带（图2）。

2.2 序列和遗传进化分析

从GenBank下载2010～2021年我国分离到的TMUV毒株共16株，根据YZ01株E基因序列，进行进化分析。如图3所示，所有17株TMUV聚类形成2大分支。除2021年分离株NTUC225/20单独形成一个分支外，包括YZ01分离株在内的16株TMUV分为1个分支，包含2个亚类。其中，分离株YZ01属于2.2分支。

2.3 攻毒试验

为评估TMUV分离株的致病性，以7日龄樱桃谷鸭为动物模型进行了感染试验。结果显示，在感染后3～6 d， YZ01感染组的樱桃谷鸭出现以精神沉郁、采食量下降、站立不稳、共济失调以及行动困难为主的临床症状。感染后4～6 d为死亡高峰期，试验结束时YZ01株感染组樱桃谷鸭的死亡率为70%（图4）。在试验期内，PBS对照组樱桃谷鸭未见异常，由此可见，YZ01株对樱桃谷鸭表现为高毒力。

2.4 攻毒保护试验

免疫组和对照组在观察期内均存活。TMUV灭活疫苗HB株对分离株YZ01的攻毒保护结果如图5所示，HB疫苗免疫组的鸭胚尿囊液RT-PCR阳性比例为2/10，感染率仅为20%，保护率高达80%；而PBS组阳性比例为9/10，感染率为90%。由此可见，疫苗株HB对分离株YZ01具有很好的保护效果。

3 讨论

TMUV最早于1955年从马来西亚的三带喙库蚊分离到，自首次分离到TMUV至2000年长达45年时间内，一直未见由该病毒所引起的某种疾病的报道。2000年，在马来西亚一个肉鸡场发现TMUV的感染[12]。直至2010年，TMUV传入我国南方养鸭地区，并迅速扩散。随着对TMUV研究的不断深入以及疫苗的上市，目前对TMUV的防控较好，多呈地方或者养殖场散发流行。但TMUV已在鸭群中流行十多年，最初感染产蛋期种鸭和蛋鸭，导致采食量和产蛋量大幅度下降、引起卵巢病变，目前已发现TMUV亦感染7周龄内小鸭，临床表现为共济失调、跛行和瘫痪等神经症状，且内脏组织无一致性病理变化[3]，因继发感染其它病原菌导致死亡和淘汰升高。

根据E基因演化分析，目前，可将TMUV分为3个基因群：1群为从马来西亚樱桃谷商品肉鸭病例分离的D1977/1/MY株和D1921/1/3/MY株；2群又分为2.1和2.2两个亚群，主要是泰国和中国TMUV分离株；3群有2个毒株（DK/TH/CU-56/2016和DK/CH/SD14/2014）[13]。2020年，Feng等用我国2015年分离到Y株（2.2分支）和2020年分离到的H株（2.1分支）分别经肌肉途径感染3周龄樱桃谷鸭，引起的死亡率分别为10%和60%[7]，提示TMUV可能存在变异株，导致TMUV的致病机制发生了改变。本研究主要选择2.1和2.2分支的不同时间分离株进行遗传演化分析，发现分离株YZ01属于2.2分支，与TMUV疫苗株HB株同属1个分支，表明扬州地区流行毒株未发生变异，且HB株对YZ01的攻毒保护率高达80%，说明疫苗免疫仍起到很好的效果。同时也提示我们，分离株YZ01株可以作為TMUV疫苗候选株。

研究者们已证实TMUV感染的严重程度与感染日龄密切相关[4-8， 14-16]，试验用鸭日龄越小，感染越严重。用TMUV空斑纯化毒株ZJ-6株经脑内、皮下和鼻内途径接种1日龄樱桃谷鸭，感染率分别为100%、60%和40%，仅脑内感染途径可导致20%雏鸭死亡[2]。由此可见，TMUV感染所致疾病的严重程度亦与感染途径有关，并以脑内途径感染最严重。因此，为评估分离株的致病性，本研究采用脑内途径感染7日龄樱桃谷鸭。

4 结论

本研究从感染鸭脾脏样品中成功分离到一株TMUV，命名为YZ01株，属于基因2.2型，是目前流行毒株，且当前疫苗对分离株有很好的保护效果。本研究为TMUV感染提供了流行病学依据。

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Isolation， Identification and Pathogenicity of Duck Tembusu Virus

LI Qun，DING Guowei，DOU Lisha，JIANG Xiaofang，FAN Juan

（Yangzhou UNI-BIO Pharmaceutical CO.，Ltd.，Yangzhou  225008，Jiangsu，China）

Abstract：   In January 2022， the 25-day-old Cherry Valley ducks from aYangzhou farm were characterized by leg paralysis and had no characteristic pathological changes after autopsy. RT-PCR results showed that ducks were infected by Tembusu virus （TMUV）. In order to isolate the virus， the treated tissue samples were inoculated to 10-day-old duck embryos through the allantoic cavity and the duck embryo isolate virus was named YZ01. The results of phylogenetic analysis showed that the virus has a similar genetic evolution relationship with other waterfowl isolates in China， belonging to the clade of 2.2. To assess the pathogenicity of the isolate， 7-day-old Cherry Valley ducks were inoculated with intracerebral route. Three days post inoculation （dpi）， the ducklings showed difficulty in movement， tremor and other symptoms， and the mortality rate of ducklings reached 70% after 7dpi. The results showed that YZ01 strain was highly pathogenic to ducklings. The results of challenge protection experiment showed that the protection TMUV HB vaccine against challenge with YZ01 was 80%. This study provides epidemiological basis for TMUV infection.

Keywords：  Tembusu virus; Isolation; Phylogenetic analysis