不同氮磷浓度对莱布新月藻生长与脂溶性物质含量的影响

阮烨烨，林雄平,2*，翁 晴，何子泓，林 浩，张芷滢

(1.宁德师范学院生命科学学院，福建 宁德 352100；2.海西海洋特色生物种质资源及生物制品开发公共服务平台，福建 宁德 352100)

莱布新月藻Closterium leibleinii属于鼓藻目鼓藻科新月藻属。国内外广泛分布，通常生长在富营养水体中[1]。新月藻对稀土元素镧有较强的吸收富集作用，同时也可以去除水体中的铅离子[2—3]。新月藻还可作为指示生物，其对阿特拉津、草甘膦、HgCl2、NaAsO2、K2Cr2O7等有害化合物具有较高的敏感度[4]。念珠新月藻C.moniliferum可将核废料中的锶和钙分开，具有清除核污染功能[5]。新月藻提取液可用于生产抗菌洗发水、护肤面膜、外科用皮肤修复膏、洗面奶等，还可作为处理污水的生物反应器。但新月藻的生长生理和活性物质提取研究较少。氮和磷营养元素是影响微藻生长重要的因子，水华蓝藻在这方面的研究较多[6—7]，而绿藻的相关研究较少。本研究探讨不同氮磷浓度对莱布新月藻生长以及脂溶性物质含量的影响，为莱布新月藻作为生物柴油开发提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莱布新月藻藻种采集于宁德师范学院校内湖泊。

实验仪器设备有88-1 大功率恒温磁力搅拌器、UV-5100H/752N 紫外可见光分光光度计、TS- 2102GZ 全温光照培养震荡器、LH-85L 隔膜真空泵、SW-CJ-1D 型单人净化工作台。

1.2 方法

1.2.1 藻种分离与培养

采用巴斯德毛细管分离法。取无菌巴氏吸管在圆口端塞少许棉花，连接在长度适当的橡胶管上。用移液枪吸取微量水样滴入盛有 3～4 滴无菌水的载玻片上，在显微镜下分离莱布新月藻细胞，并用巴氏吸管挑取藻细胞移至盛有3～4 滴无菌水的载玻片上。重复以上操作，直至载玻片的水滴中只有单个藻细胞为止。最后将洗涤的藻细胞转移至装有BG11 培养基的24 孔培养板中，封口标记后置于光照培养箱中培养。

1.2.2 饥饿处理

培养物用Millipore 滤膜过滤，用无菌的无氮BG11 培养基清洗三次后于1 L 锥形瓶中培养，培养体系为800 mL，共8 个培养体系；无磷培养与之相同。培养物进行14 d 饥饿培养以消耗内源性氮(磷)储存。每2 d 取一次样，检测莱布新月藻的生长情况，计算对应细胞密度。

1.2.3 氮磷质量浓度梯度设定

以饥饿处理后的无N-BG11、无P-BG11 培养基作为基础培养基，通过改变硝酸钠(NaNO3)、磷酸氢二钾(K2HPO4)的添加量来控制各实验组初始氮、磷质量浓度。根据莱布新月藻原生环境中水体的氮、磷质量浓度水平，氮控制组初始氮质量浓度设定8个浓度：1.3 mg·L-1(缺氮)、2.3 mg·L-1、3.3 mg·L-1、4.3 mg·L-1、4.8 mg·L-1、5.0 mg·L-1、5.3 mg·L-1、5.5 mg·L-1(BG11)，磷质量浓度为BG11 配方中原始质量浓度(0.8 mg·L-1)；磷控制组的初始磷质量浓度设定9 个浓度：0.02 mg·L-1(缺磷)、0.03 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.07 mg·L-1、0.09 mg·L-1、0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.8 mg·L-1(BG11)，氮质量浓度为BG11 配方中原始质量浓度(5.5 mg·L-1)。以BG11 培养基为对照。

1.2.4 生长情况与总氮总磷测定

通过测定藻细胞个体大小、藻细胞密度、叶绿素a 含量判定生长情况。藻细胞个体大小通过在显微镜(400 倍)下测量其长、宽、高表示；吸取 0.1 mL 均匀样品注入计数框内，在显微镜(400 倍)下进行藻细胞计数，计数 30～60 个视野，每个样品计数 2 次，结果取平均值，若前两次计数结果相差15%以上，需进行第三次计数，并取其中相近的两次计数的平均值；叶绿素 a 浓度(Chl a)测定参考照 Jeffrey等[8]的方法。总氮(TN)和总磷(TP)测定参考《水和废水监测分析方法(第四版)》[9]。

1.2.5 脂溶性物质提取

取最适氮磷浓度-BG11 (氮5.30 mg·L-1、磷0.02 mg·L-1)、缺氮-BG11、缺磷-BG11 培养基中培养13 d 的莱布新月藻，通过冷冻干燥各取0.7 g 莱布新月藻藻粉，在索氏抽提器上用石油醚(沸程60～90 ℃)在70 ℃水浴下回流抽提72 h，获得粗脂，计算其脂溶性物质含量，三次平行实验。

2 结果与分析

2.1 不同浓度氮对莱布新月藻生长的影响

2.1.1 不同浓度氮对莱布新月藻细胞密度的影响

不同氮浓度下培养的莱布新月藻细胞密度变化总体上均呈先增加后下降的趋势(图1A)。莱布新月藻在BG11 培养基中生长约20 d 后开始衰亡，藻液明显由绿变黄。其中，当氮浓度为4.80 mg·L-1、5.00 mg·L-1、5.30 mg·L-1时，莱布新月藻生长趋势相似，生长情况良好，在前24 d 都呈现明显的持续增长趋势，第24天后才逐渐减弱，有趋于平缓的趋势。这三组处理细胞数目变化最为明显，细胞增长速率较快。

图1 不同氮浓度下莱布新月藻生长指标变化曲线Fig.1 Growth index curves of Closterium leibleinii at different nitrogen concentrations

从短期生长曲线可以看出，莱布新月藻受氮浓度梯度的影响，细胞密度有明显不同，最适的氮浓度为5.30 mg·L-1，在此浓度下，莱布新月藻细胞生长速率最快，最大生长速率可达3.675×106个·L-1·d-1，培养至 25 d 时细胞数目最多，细胞密度可达2.904×107个·L-1。

2.1.2 不同浓度氮对莱布新月藻细胞大小的影响

不同浓度氮培养的莱布新月藻细胞大小存在明显差异(图1B)。取缺N-BG11 与BG11 培养的莱布新月藻测量细胞长、宽、高，并计算体积。缺N-BG11培养的细胞长具明显优势，约为BG11 培养的1.5倍，可能是低氮胁迫下碳源流向脂肪酸代谢[15—16]，从而促进油脂积累，使藻体细胞体积增大。

2.1.3 不同浓度氮对莱布新月藻叶绿素a 含量的影响

由图1C 可见，在不同氮浓度条件下，莱布新月藻生长过程中叶绿素a 含量大致随着N 浓度升高而增加。当氮浓度为5.3 mg·L-1时，莱布新月藻培养至25 d 的叶绿素a 含量最高，可达2.25×103mg·L-1，同时也证实莱布新月藻培养25 d 时细胞密度达到生长指数期。

高氮和低氮条件都会限制莱布新月藻的生长。比较氮浓度1.3 mg·L-1、2.3 mg·L-1、3.3 mg·L-1的叶绿素a 含量变化曲线可知，在缺乏氮元素的条件下，莱布新月藻生长周期较短，第10 天后生长趋势减弱，因此氮是莱布新月藻生长的限制因子；氮浓度为5.3 mg·L-1时莱布新月藻叶绿素a含量显著高于完全BG11 培养基，可见氮浓度过高会限制莱布新月藻生长(图1C)。

2.2 不同浓度磷对莱布新月藻生长的影响

2.2.1 不同浓度磷对莱布新月藻细胞密度的影响

在不同初始磷质量浓度培养中，莱布新月藻细胞密度总体上随着培养进程呈先增加后下降的趋势(图2A)。莱布新月藻在BG11 培养基中生长约12 d后开始衰亡，藻液明显由绿变黄。其中，当磷浓度为0.02 mg·L-1、0.8 mg·L-1(BG11)时，藻细胞数量增长速度较快，表现为较明显的指数生长期，但指数生长期和稳定期的持续时间不长，随后开始减慢，但藻细胞数量仍高于其他处理；磷浓度 0.03～0.5 mg·L-1培养组的细胞生长呈波动状，无明显的指数生长期。

图2 不同磷浓度下莱布新月藻的生长指标曲线Fig.2 Growth index curves of Closterium leibleinii under different phosphorus concentration

从短期生长变化趋势可以看出，莱布新月藻最适磷浓度为0.02 mg·L-1，在该浓度下藻细胞生长速率最快为4.05×105个·L-1·d-1，生长11 d 时，细胞数目最多，细胞密度最大，可达2.46×106个·L-1。比较莱布新月藻指数期所对应的培养天数，最适氮条件下所达到的指数期培养天数约为最适磷条件下的2.27 倍，进一步证实在氮胁迫条件下，细胞生长受阻，发育缓慢。

2.2.2 不同浓度磷对莱布新月藻细胞大小的影响

由图2B 可见，莱布新月藻在不同浓度磷培养中，其细胞大小存在明显差异。取最适磷浓度为0.02 mg·L-1(氮浓度5.5 mg·L-1)的培养基与BG11 培养基中培养的莱布新月藻测量细胞长、宽、高，并 计算其体积，结果表明，在磷浓度为0.02 mg·L-1培养基中培养的莱布新月藻，细胞长、宽、高均存在优势，其中长具有极显著优势，是BG11 培养基中莱布新月藻细胞的两倍。由此推测，在磷胁迫条件下有利于莱布新月藻细胞体积的发育。

2.2.3 不同浓度磷对莱布新月藻叶绿素a 含量的影响

当磷浓度为0.03～0.5 mg·L-1时，莱布新月藻的叶绿素a 含量变化趋势相似(图2C)；在完全BG11培养基中，叶绿素a 含量较高；而当磷浓度为0.02 mg·L-1时，叶绿素a 含量最高，培养30 d 后可达1.54×103mg·L-1，为最适氮浓度条件下最高叶绿素a 含量的76%。

2.3 不同氮磷浓度对莱布新月藻的脂溶性物质含量的影响

最适氮磷BG11 培养的莱布新月藻粗脂约占藻体干重的88.04%；缺氮BG11 培养的粗脂约占藻体干重的79.42%；缺磷BG11 的粗脂约占藻体干重的74.09%(图3)。可见氮磷充足有利于莱布新月藻脂溶性物质的合成和积累，而在缺氮条件下由于蛋白质合成受到影响，间接影响到脂类合成，在缺磷条件下则会直接影响脂类合成，且明显大于缺氮的影响。因此，在最适氮磷浓度BG11 培养基中微藻粗脂提取率最大，缺氮BG11 培养基中粗脂提取率次之，缺磷BG11 培养基中粗脂提取率最小。

3 结论与讨论

研究表明，莱布新月藻生长的最适氮浓度为 5.3 mg·L-1，最适磷浓度为0.02 mg·L-1，其中氮是莱 布新月藻生长的重要限制因子。莱布新月藻在最适氮浓度下(氮5.3 mg·L-1、磷0.08 mg·L-1)和最适磷浓度下(氮5.50 mg·L-1、磷0.02 mg·L-1)细胞密度随培养时间呈明显的动态变化，当生长至指数期时，最适氮条件下的莱布新月藻细胞密度约为最适磷条件下藻细胞数的11.8 倍，因此最适氮培养基较最适磷培养基更适合莱布新月藻生长。

鼓藻目种类复杂、生态幅度较宽，生长易受环境因子干扰，常用于水质检测与评价，是重要的指示植物[12-13]。莱布新月藻属鼓藻目鼓藻科，其生长最适水体磷浓度为0.02 mg·L-1，符合《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)中规定的Ⅰ类水质总磷标准浓度，且该藻对水体磷浓度有极为严苛的生长要求，当水体磷浓度高于0.02 mg·L-1时，藻细胞密度呈明显的下降趋势，但该藻在一个生长周期中有两个藻细胞浓度峰值，当水体磷浓度持续上升至0.8 mg·L-1时，藻细胞浓度明显增大，与最适磷浓度培养下的细胞密度十分接近，因此莱布新月藻不适合作为优质水环境的指示生物。这与王狄宁等[12]调查新疆北部湿地鼓藻科的结果不一致。

藻细胞的生长周期与细胞体积呈正相关。刘祚屹等[14]指出，微藻体积决定藻种的最大比生长速率，体积越大，最大比生长速率越低。本研究表明，莱布新月藻生长周期为24 d，其生长周期与细胞体积均为普通微型藻的2～3 倍，也说明藻细胞体积是影响微藻生长周期和最大比生长速率的重要因子之一。

微藻光合系统Ⅱ在缺氮条件下，最大光化学效率Fv/Fm下降，电子传递受阻，藻细胞光合作用受抑制[15]。本研究显示，莱布新月藻在氮胁迫下叶绿素a 含量显著降低。以指数期作为参照，氮胁迫下的细胞密度约为磷胁迫的11.6 倍，而在相同时间点氮胁迫的叶绿素a 含量仅为磷胁迫的1.31 倍，可知氮胁迫下叶绿素a 含量大幅降低。

氮、磷是影响微藻脂溶性物质积累的重要因子。本研究表明，莱布新月藻在最适氮磷浓度条件下油脂含量最高，缺氮条件下次之，缺磷条件下最少。这与石琦等[13]、聂煜东等[16]的研究结果相似，说明鼓藻类在氮胁迫下油脂含量下降较小，而在磷胁迫条件下油脂含量降低明显。

徐春明等[17]指出，优良的能源微藻需满足生长快、油脂含量高、易培养等特点。本实验表明，莱布新月藻在最适氮磷BG11 培养中粗脂含量可达藻体干重的88.04%，符合优良能源微藻对油脂含量的要求，莱布新月藻具有潜在的柴油开发优势。但由于该藻生长周期较长，因此暂不满足优良能源藻株的标准，需进一步探索缩短培养时间的途径，为生物能源领域开发提供优质种质资源。