干旱胁迫对烟草两品种幼苗生理生化特性及NtDEGP5 基因表达的影响

舒彦淇，罗家骏，贾傛吏，段丽丽，莫泽君，刘仁祥

(贵州大学烟草学院，贵州 贵阳 550025)

烟草Nicotiana tabacum是我国西南地区重要的经济作物。然而，西南地区春旱天气频发，给烟草的生长发育和生理代谢造成不利影响，进而降低烟叶产量和品质[1]。因此，提高烟草苗期抗旱性，使其在春旱条件下能正常生长发育，对实现烟草优质丰产栽培有重要的现实意义。烟草起源于热带地区，干旱胁迫直接或间接影响其叶片光合系统[2]。植物缺水会降低叶片气孔开度，导致叶片蒸腾速率和二氧化碳同化能力降低，PSⅡ反应中心暂时失活或受到不可逆的伤害，导致初始荧光(F0)上升以及最大光化学效率(Fv/Fm)下降，因此Fv/Fm 常作为衡量植株受伤害程度的重要指标[3]。干旱胁迫还引起植物体内活性氧(ROS)增加，使膜脂质过氧化，积累丙二醛(MDA)，损伤细胞膜。植物抗氧化胁迫性常被用于判断其抗旱能力。植物可通过提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)等抗氧化酶活性来清除活性氧，增强植物抗氧化防御能力可提高植物对干旱胁迫的耐受性。因此POD、SOD 活性及MDA 含量也常被作为衡量植株受伤害程度的重要指标[4]。DEG 蛋白酶(也称DEGP 蛋白酶)是一类存在于植物叶绿体中的丝氨酸蛋白酶，主要参与PSⅡ的修复循环[5]。在逆境(干旱)胁迫下，拟南芥Arabidopsis thaliana野生型和DEG5 突变体的Fv/Fm 均显著下降，但野生型较突变体稳定，野生型的Fv/Fm 在胁迫处理过程中的降低速度明显小于突变体[6]，说明AtDEGP5基因通过调节Fv/Fm，从而调控逆境胁迫下PSⅡ的修复循环，推测DEGP5基因可能具有抗旱性。为此，本研究选择烟草抗旱品种NC82 与干旱敏感品种云烟87 幼苗为材料[7—8]，利用PEG-6000模拟干旱处理，测定烟苗Fv/Fm、SOD 活性、POD活性、MDA 含量和NtDEGP5基因的相对表达量，以期筛选烟草苗期抗旱性评价指标，分析NtDEGP5基因表达量与抗旱评价指标间的相关性，探讨该基因的抗旱性功能。

1 材料与方法

1.1 材料

选择烟草抗旱性强的品种NC82 和干旱敏感品种云烟87 为材料，种子由贵州大学烟草品质重点实验室提供。

1.2 试验设计

参考关扬扬等[9]的方法，采用漂浮育苗。待烟苗长至4 叶1 芯时，选取长势一致的幼苗洗净根系泥土，放入装有质量体积分数为0、5%和15% PEG-6000 的 Hoagland 营养液的试管中，设置3 次重复。分别于处理0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h后，取幼苗根、茎、叶用液氮速冻，放入-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.3 生理生化指标测定与基因表达分析方法

1.3.1 光合指标测定

5% PEG-6000 处理后0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h，自上往下取第2、3 片展开叶，采用便携式叶绿素荧光仪(PAM-2500)测定光合荧光参数。

1.3.2 生化指标测定

分别取15% PEG-6000 处理0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h 的烟苗叶片，参照苏州格瑞思生物技术有限公司试剂盒的方法测定POD 活性、SOD 活性及MDA 含量。

1.3.3NtDEGP5基因相对表达量测定

取参试品种处理0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h的根、茎、叶样品，采用 Trizol 法提取烟草样品 RNA，再用试剂盒(擎科公司)合成 cDNA 第一链。NtDEGP5基因的引物序列见表1，RT-PCR 反应体系和程序均参照赵婷婷等[10]的方法，最后采用2-ΔΔCT法计算基因表达量。

表1 NtDEGP5 引物序列Table 1 Primer sequence of NtDEGP5

1.3.4NtDEGP5基因的克隆及生物信息学分析

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得拟南芥DEGP5基因的核苷酸序列，利用此序列在NCBI 中与普通烟草进行同源比对得到同源基因；利用在线数据库Expasy 中的ProtParam 系统(https:// web.expasy.org/protparam/)对拟南芥DEGP5及烟草同源基因核苷酸序列进行亲水性及疏水性等理化性质分析；利用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?ppage=npsa_sopma.html)分析预测蛋白质二级结构；利用Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分析预测蛋白质三级结构。

1.4 数据处理

用SPSS 20.0 软件对数据进行相关性分析，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)法进行数据处理、最小显著差数(LSD)法进行显著性检验，利用Origin 2018 软件作图。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对烟苗生理生化指标的影响

2.1.1 干旱胁迫对烟苗最大光化学效率(Fv/Fm)的影响

如图1 所示，非干旱条件下两个烟草品种在处 理期间的最大光化学效率保持在0.4～0.6 之间，且差异不显著；干旱胁迫下，两个烟草品种的最大光化学效率随干旱时间的延长逐渐下降，处理0～3 h时最大光化学效率下降速率最快，其中云烟87 从胁迫开始至6 h 时其最大光化学效率的下降速率快于NC82，6 h 后两品种的最大光化学效率下降速率基本保持一致。说明在干旱胁迫下云烟87 与NC82 的PSⅡ的潜在活性被明显抑制，NC82 受到的抑制作用更小，潜在光化学效率较云烟87 更高。

图1 干旱胁迫处理下烟苗Fv/Fm 的变化Fig.1 Changes of Fv/Fm in tobacco seedlings under drought stress

2.1.2 干旱胁迫对烟苗叶片过氧化物酶(POD)活性的影响

植物受到干旱胁迫时，POD 活性增加，清除低浓度过氧化物。由图2A 可见，正常生长条件下，NC82 与云烟87 品种间的POD 活性无显著差异。干旱胁迫后，两品种的POD 活性呈先上升后下降的趋势，且品种间存在显著差异。NC82 的POD 活性在干旱胁迫9 h 时达最高值(272.25 U·g-1·min-1)，较对照提高95.58%。整体来看，NC82 的POD 活性在干旱胁迫期间存在显著变化，而云烟87 的POD 活性在胁迫期间变幅没有NC82 大，说明NC82 能通过提高自身POD 活性来适应干旱胁迫。

图2 干旱胁迫对烟苗叶POD (A)、SOD (B)活性及MDA 含量(C)的影响Fig.2 Effects of drought stress on POD (A), SOD (B) activities and MDA content (C) in tobacco seedlings leaves

2.1.3 干旱胁迫对烟苗叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响

超氧化物歧化酶SOD 可催化超氧阴离子自由基发生歧化反应。一般而言，当植物受到干旱胁迫时，SOD 活性升高，且抗旱性强的品种 SOD 活性提高幅度更大。干旱胁迫处理下NC82 和云烟87 品种在未经胁迫处理时(0 h)，两品种的SOD 活性无明显差异；胁迫处理期间，两品种的SOD 活性呈现先升高后降低的趋势，NC82 在干旱胁迫9 h 时SOD活性达到最大值，为406.04 U·g-1·min-1，比对照提高43.96%，差异显著(图2B)。干旱胁迫9 h 后，NC82 与云烟87 的SOD 活性显著下降，在胁迫处理12 h 时逐步趋于稳定，胁迫处理24 h 后较对照分别降低33.38%和47.37%。说明NC82 通过提高SOD 活性来适应干旱胁迫，NC82 的抗氧化能力优于云烟87。

2.1.4 干旱胁迫对烟苗叶片丙二醛(MDA)含量的影响

丙二醛(MDA)是脂质过氧化的主要产物之一，其含量在一定程度上反映脂膜过氧化水平和膜结构受损害程度，与植物的抗旱能力呈负相关。如图2C所示，在正常生长条件下NC82 和云烟87 的MDA含量无显著差异。在干旱胁迫下，两品种的MDA含量随着处理时间的延长呈先升高后降低的趋势，NC82 在整个胁迫期间MDA 含量变幅较小，而云烟87 的MDA 含量增加较快。干旱胁迫处理9 h 时，两个品种的MDA 含量达最高，其中NC82 的MDA含量为24.25 nmol·g-1，较对照提高12.15%，云烟87 的MDA 含量为33.83 nmol·g-1，较对照提高21.62%。说明NC82 较云烟87 更能适应干旱胁迫对细胞膜的损伤，NC82 抗旱性更强。

2.2 NtDEGP5 基因的生物信息学分析

2.2.1 烟草NtDEGP5 理化性质分析

对拟南芥AtDEGP5 及烟草NtDEGP5 蛋白质的理化性质进行分析(表2)。AtDEGP5 与NtDEGP5 的氨基酸数量相近，分子量相差较小，等电点相近，脂溶性、亲水性相似，说明AtDEGP5 与NtDEGP5的理化性质相近，推测NtDEGP5基因与AtDEGP5基因一样具有抗旱性功能。

表2 DEGP5 蛋白质理化性质分析Table 2 Physical and chemical properties of DEGP5

2.2.2 蛋白质二级及三级结构预测

对AtDEGP5 与NtDEGP5 蛋白质的二级结构(表3)与三级结构(图3)进行预测，发现AtDEGP5 与NtDEGP5 的α 螺旋分别为22.52 和21.57，β 转角分别为9.10 和10.13，延伸链分别为23.33 和26.47，而无规则卷曲分别为39.05 和41.83，AtDEGP5 与NtDEGP5 的二级结构、三级结构有着高度的相似性，进一步说明NtDEGP5基因可能具有调控抗旱性的功能。

图3 DEGP5 蛋白质三级结构分析Fig.3 Tertiary structure analysis of DEGP5

表3 DEGP5 蛋白质二级结构分析Table 3 DEGP5 protein secondary structure analysis

2.3 干旱胁迫下烟草两品种不同器官NtDEGP5 基因的差异表达

2.3.1 干旱胁迫下叶片NtDEGP5基因相对表达量变化

在未经干旱胁迫时(0 h)，两品种叶片的NtDEGP5基因相对表达量无显著差异(图4A)。轻度胁迫下(5% PEG)，NC82 叶片的基因相对表达量在处理0～6 h中无显著差异，处理9 h 时达最大值(11.82)，是对照的11.81 倍，且差异显著；云烟87 叶片的NtDEGP5基因相对表达量与对照无显著差异。重度胁迫下(15% PEG)，NC82 叶片NtDEGP5基因相对表达量随干旱胁迫时间延长呈先升高后降低的趋势，处理9 h 时达最大值(33.55)，显著高于对照处理；而云烟87 叶片的NtDEGP5基因相对表达量与对照无显著差异。由此可知，NC82 叶片的NtDEGP5基因表达量在胁迫处理9 h 时最高，且在重度干旱胁迫下表达量更高，而云烟87 叶片中NtDEGP5基因与对照相比无显著性差异。

图4 干旱胁迫对两品种烟草叶(A)、茎(B)、根(C)的NtDEGP5 基因相对表达量的影响Fig.4 Effects of drought stress on the relative expression of NtDEGP5 in leaves (A), stems (B) and roots (C) of two tobacco cultivars

2.3.2 干旱胁迫下茎的NtDEGP5基因相对表达量变化

正常生长条件下，两烟草品种茎的NtDEGP5基因相对表达量无显著差异(图4B)。轻度胁迫下(5% PEG)，NC82 与云烟87 茎的NtDEGP5基因相对表达量变化相似，在处理3 h 时显著下调，6 h 时显著上调，9～24 h 间相对表达量显著下调。重度胁迫时(15% PEG)，随着胁迫时间的延长，NC82 茎的NtDEGP5相对表达量呈先升高后降低的趋势，在9 h时达到最大值(9.69)，为对照的9.68 倍；而云烟87茎的NtDEGP5相对表达量逐渐下降，处理9 h 的表达量为0.43，几乎不表达。

2.3.3 干旱胁迫下根的NtDEGP5基因相对表达量变化

在干旱胁迫0～9 h 时，烟草两品种根部的NtDEGP5基因相对表达量与对照无显著差异，两品种间差异也不显著(图4C)；处理12～24 h 时，两品种根的NtDEGP5基因相对表达量较对照显著降低，两品种间的差异不显著。说明在处理12～24 h 两品种的根部NtDEGP5基因表达对干旱胁迫有响应，且基因相对表达量显著低于对照。

2.4 烟草叶片NtDEGP5 基因相对表达量与生理生化指标的相关性

不同干旱胁迫处理下叶片NtDEGP5基因相对表达量与其生化指标的相关性分析表明，15% PEG-6000 处理下，NC82 叶片中NtDEGP5表达水平与POD 活性、MDA 含量呈极显著或显著的正相关，5% PEG-6000 处理下，NC82 叶片中NtDEGP5表达水平与Fv/Fm 呈显著正相关；而云烟87 叶片中NtDEGP5基因表达水平与POD 活性、MDA 含量及Fv/Fm 无显著相关(表4)。

表4 不同处理烟草叶片NtDEGP5 基因相对表达量与生理生化指标的相关性分析Table 4 Correlation analysis between NtDEGP5 relative expression and physiological and biochemical indexes in tobacco leaves under different stress treatments

3 讨论

3.1 烟草苗期抗旱性指标筛选

干旱胁迫使植物体内ROS 增加，膜脂质过氧化，MDA 累积，细胞膜受损伤[11]，但植物自身可通过产生SOD、POD 等抗氧化酶来清除活性氧[12—13]。增强植物的抗氧化防御能力可提高植物对不同胁迫因子的耐受性，使POD 活性与MDA 含量上升，提高酶促防御能力与维持较好的细胞渗透平衡而减轻干旱胁迫的伤害[14]。研究表明，烟草抗旱品种POD、SOD 活性较强，MDA 含量较低[15—18]。本研究显示，随着干旱胁迫程度加强，抗旱品种NC82 幼苗叶片SOD、POD 活性增长幅度均大于不抗旱品种云烟87，MDA 含量低于云烟87，说明SOD、POD 活性及MDA 含量可作为烟草苗期抗旱性评价指标。干旱胁迫还导致植物新陈代谢和内源激素平衡发生紊乱，造成植物细胞脱水，致使PSⅡ反应中心的D1蛋白受损[19]。植物Fv/Fm 能反应清除受损的D1 蛋白的效率，从而保证植物PSⅡ的正常运行，进而提高抗旱性。干旱处理下NC82 幼苗叶片的Fv/Fm 下降速率远低于云烟87，说明Fv/Fm 能作为烟草苗期抗旱性评价指标。

3.2 NtDEGP5 基因的功能预测

生物信息学分析作为一种预测基因功能的方法，在对基因的功能验证上有着不可或缺的作用。通过对目的基因的预测，可为今后的研究方向打下基础[20]。拟南芥野生型和DEGP5 突变体的叶片在干旱胁迫0～3 h 过程中Fv/Fm 均显著下降，PSⅡ的最大光化学效率在干旱胁迫处理过程中有所降低。相对于野生型，对于干旱胁迫，突变体的光化学效率降低更多，突变体对干旱胁迫的适应性下降，说明AtDEGP5基因具有抗旱的功能[21—24]。本研究通过生物信息学分析对烟草NtDEGP5基因功能进行预测，发现NtDEGP5 与AtDEGP5 的理化性质相似度高，两种蛋白的二级结构和三级结构也有着高度的相似性。因此，推测烟草NtDEGP5基因与拟南芥AtDEGP5基因的功能相似，都具有调控抗旱性功能。

3.3 NtDEGP5 基因的表达分析

性状的改变能较好地反映基因的功能[25]。本研究对NtDEGP5基因的表达分析发现，非干旱处理下NC82 和云烟87 的NtDEGP5基因表达量没有显著差异。而在干旱胁迫处理下，NC82 烟苗叶片中NtDEGP5基因上调表达，且随干旱胁迫增强上调表达越明显，但在烟苗根和茎的表达变化不明显；云烟87烟苗叶片中NtDEGP5基因的表达无明显变化，根和茎的NtDEGP5表达量变化不明显。说明NtDEGP5基因能响应干旱胁迫，且主要在叶片中表达。NC82 幼苗叶片的NtDEGP5基因表达水平与POD 活性、MDA 含量和Fv/Fm 等抗性指标呈显著或极显著相关，而云烟87 烟苗叶片中NtDEGP5基因表达水平与POD 活性、MDA 含量和Fv/Fm 无显著相关，进一步说明NtDEGP5基因表达可能调控烟草抗旱性。

4 结论

通过测定干旱胁迫下烟草抗旱品种NC82 和干旱敏感品种云烟87 幼苗的生理生化指标，采用生物信息学方法预测NtDEGP5基因的功能，并检测干旱胁迫处理下两品种幼苗的NtDEGP5基因表达量，分析NtDEGP5基因表达量与生理生化指标的相关性。结果表明，烟草叶片Fv/Fm、SOD 活性、POD 活性及MDA 含量可作为其苗期抗旱性评价指标；烟草NtDEGP5基因与拟南芥AtDEGP5基因的结构相似，可能具有相同的调控抗旱功能；NC82 幼苗叶片中NtDEGP5基因表达水平与POD 活性、MDA 含量和Fv/Fm 等抗性指标呈显著或极显著相关，间接说明NtDEGP5基因表达与烟草抗旱性调控有关。