微波法合成的ZnS/RGO纳米材料对核黄素的电化学检测

马榕，张文坤，乔雅雪，范琪，李宁波，2*，乔洁，2*

（1.山西医科大学 生物化学与分子生物学教研室 基础医学院，山西 太原 030001；2.山西医科大学 基础医学院 化学教研室，山西 太原 030001；3.山西医科大学 公共卫生学院 预防医学系，山西 太原 030001）

0 引言

核黄素（Riboflavin，RF）是人体正常代谢活动所必需的水溶性维生素之一，俗称维生素B2，在人体正常的生命活动中起着至关重要的作用。它不仅能够调节重要的营养物质，如：碳水化合物、脂肪和蛋白质转化为生化反应所需的直接能源ATP（腺嘌呤核苷三磷酸），还可以促进黄素单核苷酸 （Flavin mononucleotide，FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，FAD）这两种黄素辅酶的形成，并且这两种辅酶是组织呼吸所必需的［1-3］。当人体内缺乏核黄素时会导致皮肤瘙痒、眼睛灼烧、口腔和舌头疼痛，严重的会诱发癌症和肿瘤［4］。因此，研制快速、准确、方便、灵敏的检测核黄素的方法尤为重要。目前，检测核黄素方法有液相色谱法［5］、分光光度计法［6］、毛细管电泳法［7］和荧光法［8］等。然而，这些方法存在耗时长、测试过程复杂、仪器昂贵等不足。相比以上方法，电化学方法具有简单、低成本、快速响应和高灵敏度等优点，是可依赖且具有发展前景的检测技术。

为了提高核黄素检测的灵敏度，研究者合成了多种电极修饰材料，有聚合物、贵金属和金属氧化物等。Derakhshan 等［9］合成氧化石墨烯、金纳米粒子、乙烯基磺酸钠盐和甲基咪唑离子液体聚合物的纳米复合材料（GO/Au/poly-EAmVS）用于核黄素的检测；Sumathi 等［10］合成α-Fe2O3、多壁碳纳米管和金纳米粒子复合材料（α-Fe2O3/MWCNT/AuNPs）修饰玻碳电极，实现核黄素的检测。但是上述材料大多需要使用改性剂，合成过程繁琐，合成成本比较高。ZnS作为一种重要的半导体材料，廉价易得，而且具有良好的生物相容性，化学稳定性和光电化学性质［11］。Vinoth 等［12］以超声法合成了包覆在还原氧化石墨烯上的硫化锌微球 （Zn-SNPs@RGO）并成功应用于咖啡酸的电化学检测，展现了ZnS 对酚类物质的催化能力。另外，石墨烯材料具有优良的导电性和高比表面积，其表面可以负载更多纳米粒子，其组成和结构具有促进电子转移的作用，可以有效地提高电化学传感器的导电性和灵敏度［13-14］，是一种理想的电化学敏感材料。因此，本研究结合石墨烯和ZnS 的优良特性，通过简单、绿色的微波法一步合成了ZnS/RGO 复合材料。该合成方法不仅避免了繁琐的反应过程、高温及有毒还原剂的使用，而且ZnS 纳米材料有效地改善了石墨烯在还原过程中的团聚，提升了复合材料的导电性和催化性能，充分发挥出复合材料的协同作用。该复合材料构建的电化学传感器，对核黄素表现出较高的催化能力，实现了对核黄素的灵敏检测，并成功应用于牛奶和血清样品中核黄素的检测，如图1 所示。

图1 电化学传感器构建用于检测核黄素的示意图Fig.1 Schematic diagram of electrochemical sensor construction for detection of Riboflavin

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

JEM-2100 型透射电子显微镜（日本电子株式会社），BRUKER INVENIOS 傅里叶变换红外光谱仪（Bruker OPTIC China service team），UH-5300 紫外分光光度计（日本Hitachi 公司），D8-X射线衍射仪（Bruker OPTIC China service team），Renishaw inVia 激光拉曼光谱仪（Renishaw 公司），G70D20CN1P-D2 微波炉（广东格兰仕微波生活电器制造有限公司），KQ-50DB 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），SCIENTA-10N 钟罩式冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司），VCX150 细胞破碎仪（SONICS& MATERIALS INC），CHI660E 工作站（上海辰华），玻碳电极GCE（Φ=3 mm）作为工作电极，Ag/AgCl 为参比电极，铂丝为对电极。

核黄素、乙酸锌、叶酸、葡萄糖、抗坏血酸、L-赖氨酸（阿拉丁试剂有限公司）；无水氯化钙、氯化钠（南京化学试剂有限公司）；硫脲（萨恩化学技术有限公司）；石墨薄片（Alfa Aesar）。实验所用试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水（电阻率达到18.2 MΩ·cm）。

1.2 ZnS/RGO的制备

首先，采用改进的Hummers 方法［15］合成氧化石墨，再利用超声剥离法制备氧化石墨烯（GO）。利用微波法制备ZnS/RGO 纳米材料，具体步骤如下：分别称取0.658 5 g Zn（Ac）·2H2O、0.266 4 g 硫脲与0.100 0 g 氧化石墨烯，加入50.0 mL 超纯水，在室温下磁力搅拌2 h，得到均一溶液。用量筒准确量取5.0 mL 上述溶液并转移至坩埚中，在700 W 的微波炉中加热30 min。待产物冷却到室温后，以8000 r/min 的转速离心收集产物，用乙醇和超纯水分别洗涤三次，冷冻干燥，得到黑色产品为ZnS/RGO，取一定量超声分散在超纯水中，得到浓度为1 mg/mL 的水溶液，贮存于4 °C 冰箱备用。在相同条件下分别合成ZnS 和RGO（注：合成ZnS 的时候不加入GO；合成RGO 不加入乙酸锌和硫脲）。

1.3 ZnS/RGO/GCE传感器的构建

为使玻碳电极能够达到最佳修饰效果，需打磨处理，在超纯水中超声清洗，自然晾干。用移液枪移取5 μL ZnS/RGO（1 mg/mL）滴涂在电极表面，室温干燥后，再重复滴加5 μL 修饰材料，干燥备用。

1.4 核黄素的测定

制备好的修饰电极室温下分别浸入含有不同浓度（从低到高）核黄素的磷酸缓冲溶液（PBS，0.1 mol·L-1，pH=6.0）中，用差分脉冲伏安法（DPV）记录对应峰电流的强弱，DPV 参数设置：振幅 50 mV，脉冲宽度 0.050 s，扫描电位窗口-0.6 ～ -0.1 V，扫描速度50 mV/ s。

1.5 实际样品处理

选择牛奶和血清为实际样品，通过加标回收法测定核黄素。牛奶购自伊利，血清来自实验室健康的志愿者。检测前需要对样品进行预处理：先用0.22 μm 的滤膜过滤除去杂质，以转速8000 r/min 离心（牛奶离心10 min，血清离心30 min），取上清液做加标回收实验。用PBS（0.1 mol·L-1，pH=6.0）为稀释剂，将上清液稀释50 倍。

2 结果与讨论

2.1 ZnS/RGO的表征

如图2（A）的紫外-可见吸收光谱所示，ZnS（a）在波长300 nm 左右表现出典型的吸收峰，GO （d）在230 nm 左右表现出最大吸收，在302 nm 处出的肩峰对应于GO 中芳香族C=C键的π-π*跃迁和C=O 键的n-π*跃迁。通过微波法将GO 还原后，RGO（b）在230 nm 的吸收峰红移至258 nm，肩峰消失不见，说明GO 被还原［16］。复合物 ZnS/RGO（c）除显示出ZnS 的紫外特征峰，在200 nm ～ 400 nm 范围内的紫外吸收强度增强［17］。

图2 （A） 紫外-可见吸收光谱；（B） 红外光谱图ZnS （a），RGO （b），ZnS/RGO （c），GO （d）Fig.2 UV-vis absorption (A) and IR spectrum (B) of ZnS (a), RGO (b), ZnS/RGO (c), GO (d)

如图2（B）红外谱图所示，ZnS（a）在472 cm-1和668 cm-1处出现了特征峰，对应Zn-S 键的振动峰［18］，3300 cm-1和1500 cm-1左右的峰为-OH 的伸缩振动峰。GO（d）出现在 1725、1624、1394、1044 cm-1处的吸收峰［19］，分别对应羧基（-COOH）、羰基（C=O 键）、酚羟基（C-O-H）和环氧基团（C-O-C）的振动峰，3406 cm-1处宽且深的峰为-OH 的振动峰。通过RGO（b）和ZnS/RGO（c）可以明显看出，在经过微波还原之后，GO 中所有含氧基团的吸收峰均有不同程度的减小，说明GO 已被还原。图3（A）为拉曼图，其中，ZnS/RGO 复合物的ID/IG值高于GO、RGO，说明复合物比RGO 有更多的缺陷位点，也进一步证实了RGO 的还原。

图3 （A） 拉曼光谱GO （a），RGO （b），ZnS/RGO （c）；（B） XRD谱图：ZnS/RGOFig.3 Raman spectrum (A) of GO (a), RGO (b), ZnS/RGO (c) and XRD spectrum (B) of ZnS/RGO

为研究复合材料晶体结构，对ZnS/RGO 样品进行了XRD 分析。如图3（B）所示，主要衍射峰28.71（111）、48.68（220）、57.12（311）与闪锌矿结构的ZnS 晶面特征峰吻合［20］，证实材料中含有ZnS。

进一步通过透射电镜图（TEM）表征石墨烯复合物的形貌。如图4 所示，均可以观察到石墨烯常见的褶皱结构，图4（a）中不规则的ZnS 纳米粒子附着在石墨烯上，相比RGO（c），ZnS 也可以降低石墨烯片层的团聚。

图4 透射电镜图ZnS/RGO （a），GO （b），RGO （c）Fig.4 TEM of ZnS/RGO (a), GO (b), RGO (c)

2.2 ZnS/RGO修饰电极对核黄素的电化学响应

为探究ZnS/RGO 复合材料对核黄素的电催化增强效应，分别考察了裸电极（GCE）、RGO修饰玻碳电极（RGO/GCE）、ZnS 修饰玻碳电极（ZnS/GCE）、ZnS/RGO 修饰玻碳电极（ZnS/RGO/GCE）在PBS（pH=6.0）和含RF 的PBS 溶液（1 mmol·L-1，pH=6.0）中的循环伏安（Cyclic voltammetry，CV）行为。图5 可以看出，ZnS/RGO/GCE 对RF 的电流响应最大，证实了ZnS/RGO/GCE 具有优良的电催化性能和导电性能，同时表现出RGO 和ZnS 的协同作用。

图5 不同修饰电极在（a）无核黄素（b）有核黄素存在下的CV图Fig.5 CVs of different modified electrode in the absence (a) and presence of RF (b)

2.3 核黄素检测条件的优化

研究材料滴涂量、溶液pH 及扫描速度对RF 在ZnS/RGO/GCE 上响应电流的影响。首先考察1 mg/mL ZnS/RGO 水溶液在玻碳电极上滴涂量的影响，图6（a）中当滴涂量由6 μL增加到10 μL 时，电极在核黄素溶液中的响应电流逐渐增大，当用量超过10 μL 时，电流反而下降。可能因为电极表面的修饰膜太厚，阻碍了电极表面的电子转移。因此，选择10 μL 为最佳修饰量。接着对待测物的pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）进行优化。如图6（b）所示，随着pH 值的增加，RF 的峰电位值逐渐负移，此现象表明在RF 的催化氧化过程中有氢离子的参与。在内插图中可以看出当pH=6.0 时，RF 响应电流达到最高值，故pH=6.0 选为最优值。最后，测定修饰电极在不同扫描速度下的CV曲线。图6（c）所示，在10～100 mV·s-1内，RF 的氧化还原峰电流峰随着扫速的增加而渐渐增大，且氧化峰电位正向移动，还原峰电位负向移动。图6d 为氧化峰（Ipa）、还原峰（Ipc）分别对扫描速度平方根（v1/2）拟合，得出Ipa=0.886 02v1/2+2.006 24、Ipc= -0.607 60v1/2-6.396 93。可判断出RF 在ZnS/RGO/GCE 上的电化学行为是由扩散过程控制的。

图6 （a） 材料滴涂量； （b）溶液pH；（c）扫描速度对核黄素响应电流的影响；（d） Ipa和Ipc与v1/2的线性拟合图Fig.6 Effect of drop-coating volume (a); pH values of solution (b); scan rate (c) on the current of RF; the calibration plots of peak current vs square root of scan rates (d)

2.4 电化学传感器对核黄素的线性检测

在最佳实验条件下，采用DPV 法对不同浓度的核黄素进行测定，结果显示，在0.3～1 μmol·L-1和1～80 μmol·L-1浓度范围内，核黄素的峰电流与浓度之间呈现良好线性关系，如图7A，其相应的回归方程为：y=0.875 387C-0.215 19（R2=0.992 3，图7（b））和y=0.111 601C+0.838 596（R2=0.996 9，图7（c））。最低检测限（LOD）为0.029 μmol·L-1（S/N=3）。与已报道的电化学传感器相比，本传感器对核黄素的检测在线性范围、灵敏度以及检测限方面具有较大优势（见表1），其优良的传感性能来源于石墨烯良好的导电性和ZnS 的催化作用。两种材料之间的协同作用使得电极表面的电子移动空间和活性位点增大增多。

表1 测定RF的电化学方法对比Table 1 Comparison of this method with the other electrochemical methods for determination of RF

图7 （a） ZnS/RGO/GCE在不同浓度的核黄素溶液中DPV图；（b） 0.3 μmol·L-1～1 μmol·L-1；（c） 1 μmol·L-1～80 μmol·L-1的核黄素与电流的线性拟合图Fig.7 (a) DPV of ZnS/RGO/GCE in PBS solution containing different RF; Calibration curves of peak current vs RF concentration for (b) 0.3-1 μmol·L-1 and (c) 1-80 μmol·L-1

2.5 电化学传感器的重现性、稳定性和选择性

为评估ZnS/RGO/GCE 的重现性和稳定性，将修饰好的电极在1 mmol·L-1核黄素溶液中进行CV 扫描，10 次循环测试之后，发现对于核黄素的响应电流仍能保持首次测定时还原峰电流值的97.85% （图8（a）），10 次结果的相对标准偏差RSD 为5.77%。此外，平行修饰五支玻碳电极，对同一溶液进行CV 测定。如图8（b）所示，RSD 为1.83%。说明该材料具有优异的重现性。在4 °C 下，将ZnS/RGO/GCE 存放10 d 后对核黄素进行测定，其电流信号仍保持原始电流的96.05%，仅下降了3.95%，说明该材料具有良好的稳定性 （图8（c））。最后，考察在实际检测中可能对核黄素测定存在影响的生物分子及无机离子，如：NaCl、GaCl2、Glu、FA、Lys、Vc 等。在含有1 mmol·L-1核黄素的溶液中分别添加同浓度的干扰物进行DPV 测试，结果如图 8（d），除GaCl2产生7.25%的信号变化，其余干扰物对于核黄素的信号改变值均小于4%，表明该传感器具有优良的选择性。

图8 ZnS/RGO/GCE的重现性（a）和（b）稳定性（c）和选择性（d）的研究Fig.8 Reproducibility (a) and (b); Stability (c) and selectivity (d) of ZnS/RGO/GCE

2.6 实际样品检测

采用加标回收法对牛奶和血清中样本中的核黄素进行测定。结果如表2 所示，选取一定浓度的加标样品，每组平行测定3 次，核黄素的回收率在95.40% ～105.73%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.06%～10.69%，此方法可用于牛奶和血清中RF 的检测（表中测定结果均为平均值）。

表2 牛奶和血清中核黄素的测定结果Table 2 Determination results of RF in milk and serum

3 结论

通过简单绿色的微波法合成ZnS/RGO 复合材料，该材料结合了ZnS 和RGO 的优良特性，展现出协同作用，对核黄素有较高的催化能力。根据这一事实，成功构建了绿色实用的用于检测核黄素的电化学传感器。最终选择修饰量10 μL，1 mg/mL 的ZnS/RGO，待测物溶剂为pH=6.0 的0.1 mol·L-1的PBS 缓冲溶液为最优检测条件，传感器在0.3 μmol·L-1～ 1 mol·L-1和1 μmol·L-1～80 μmol·L-1浓度范围内，分别呈现出良好线性关系，检出限为0.029 μmol·L-1。并用于牛奶和血清样品中核黄素的检测，回收率在95.40%～105.73% 之间，表明ZnS/RGO/GCE 有望成为一种检测核黄素的新方法。