E3泛素连接酶RNF138抑制溃疡性结肠炎的发生及进展

邓博雅，路亚岚，羽 思，张旖垚，黄婧怡，李 玥*，刘长征*

1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005；2.中国医学科学院 北京协和医学院 医学实验动物研究所国家卫生健康委员会人类比较医学重点实验室，北京 100021；3.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 消化内科，北京 100730

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种局限于结肠黏膜及黏膜下层的炎性反应过程,典型临床表现为便血、腹泻和腹痛,症状严重时可危及生命[1]。目前治疗UC的药物繁多,但仍有近1/3的患者病情难以控制,给个人和社会带来巨大的经济负担[2]。鉴于目前治疗的局限性,对其发病机制和新兴治疗靶点的探索具有重要意义。NF-κB信号通路是对环境应激、遗传毒性或感染反应的核心[3],很多促炎细胞因子受其调节参与炎性反应性肠病的发生,因此抑制NF-κB可能是治疗UC的新策略。

RNF138是一种E3泛素连接酶(E3 ubiquitinase,Ub-E3),其表达下调会使NF-κB信号异常转导,将结肠炎转变为侵袭性恶性肿瘤[4]。而RNF138在溃疡性结肠炎中的作用尚不清楚,因此探究RNF138在溃疡性结肠炎的作用至关重要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试者:2014年1月至2019年12月间于北京协和医院消化内科住院并临床诊断为溃疡性结肠炎的患者共17例。招募18岁以上的健康志愿者4例作为对照组。UC组入选标准:1)年龄>18周岁;2)确认为溃疡性结肠炎;对照组入选标准:1)年龄>18周岁;2)确认为非溃疡性结肠炎等炎性肠病。该研究获得中国医学科学院北京协和医院伦理审查委员会批准(伦理审查编号:S-K2092),患者及家属均同意并签署知情同意书。

1.1.2 小鼠:C57BL/6J背景 RNF138-KO及RNF138-WT小鼠,8周龄,体质量20±5 g(上海南方模式生物科技股份有限公司),本研究经中国医学科学院基础医学研究所北京协和医院基础学院伦理审查委员会批准(伦理审查编号SB2023052)。

1.1.3 主要试剂:葡聚糖硫酸钙(destran sulfate sodium,DSS)(MP Biomedicals公司);Anti-RNF138 抗体(实验室自制);Rabbit p-p65 抗体(Cell Signaling公司);BCA蛋白定量分析试剂盒(Pierce公司);反转录试剂盒(Transgen公司);引物 (北京擎科生物科技有限公司合成, 表1)。

表1 实时荧光定量 PCR(qPCR)引物序列Table 1 Real-time fluorescent quantitative PCR (qPCR) primer sequence

1.2 方法

1.2.1 数据库分析:GEO数据库(https://ww.ncbinlm.nih.gov/geo/)分析RNF138基因在溃疡性结肠炎活动期、缓解期以及经免疫抑制剂治疗后的表达水平; STRING数据库(https://cn.string-db.org/)对感兴趣的聚类和基因进行了蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析。

1.2.2 临床溃疡性结肠炎诊断标准:1)具有便血、腹泻和腹痛等典型临床表现;2)症状不明显时,有内镜活检证实;3)排除克罗恩病、放射性肠炎等结肠炎症。

1.2.3 制备人结肠样本切片:收集溃疡性结肠炎组(17例)和健康对照组(4例),活检结肠组织,通过固定、包埋等获得石蜡切片。

1.2.4 制备溃疡性结肠炎小鼠模型:选取状态接近的RNF138-WT及RNF138-KO小鼠做好标记;使用高压灭菌过的自来水配置DSS,给药1周(雄鼠使用2% DSS,雌鼠使用2.5% DSS)后用正常水恢复14 d。整个循环重复两次,最后一个DSS周期结束后4周处死小鼠。取结肠和脾脏,将结肠纵向切开,用PBS冲洗干净并测量其长度。取末端结直肠组织用于蛋白质、RNA以及病理的检测。

1.2.5 动物模型指标的评分标准:整个实验过程中注意观察记录小鼠的体质量、便血情况、粪便性状、精神状态以及生存死亡情况等,临床评分为类便性状评分与便血评分总和。

1.2.6 HE组织学检测:人及小鼠石蜡组织切片脱蜡,水化,切片煮沸10 min,然后用3% H2O2在室温下煮沸10 min,以淬灭内源性过氧化物酶活性。血清封闭40 min,用阻断液稀释的特异性一抗在4 ℃下孵育过夜。二抗室温孵育30 min,DAB孵育5 min,加入显色剂,用苏木精复染,脱水,封片。

1.2.7 Western blot 检测小鼠结肠组织中RNF138及p-p65蛋白的表达:使用电动研磨器在RIPA裂解液将小鼠结肠组织研磨为糊状,随后12 000 r/min离心10 min,吸取上清使用BCA定量试剂盒进行定量,随后100 ℃变性10 min,将样品加入制备好的SDS-PAGE凝胶中,使用相应一抗,二抗孵育,最后滴加显影液显影。

1.2.8 RT-qPCR 检测小鼠结肠组织中的 NF-кB靶基因mRNA 表达水平:将小鼠结肠组织研磨,加入1 mL Trizol,200 μL氯仿振荡15 s,静置10 min,随后12 000 r/min离心10 min,取上清加入等体积的异丙醇萃取,离心12 000 r/min离心15 min,向沉淀中加入1 mL的75%冰乙醇,洗涤两遍,晾干沉淀,加入DEPC水对RNA进行定量。使用反转录试剂盒70 ℃ 5 min,42 ℃ 30 min进行反转录,随后以反转录产物为模板在荧光定量PCR仪中检测进行检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 溃疡性结肠炎患者结肠组织中RNF138表达水平下调

选择GEO数据库中GDS3119, GDS218738, GDS3268, GDS2181与GDS4365等5个数据集进行分析,与正常对照组相比,RNF138在UC患者组织中表达下调,在活动期表达下调更为显著(图1A,B)。而经过免疫抑制剂治疗后RNF138水平有所上升,但依然低于正常对照(图1C)。临床21例样本(17例溃疡性结肠炎患者,4例健康对照)的免疫组化结果显示,患者结肠组织中RNF138表达水平在缓解期略高于活动期,但仍然低于健康对照(图1D)。

A-C.RNF138 expression level in GEO database (GDS3119/218738,GDS3268/2181,GDS4365/218738), *P<0.05,**P<0.001 compared with normal group, #P<0.05, ##P<0.01 compared with UC-no inflammation group, ΔP<0.001 compared with UC-remission group; D.HE and RNF138 staining in patients’ colon tissue.图1 溃疡性结肠炎中RNF138表达下调Fig 1 Down-regulation of RNF138 expression in ulcerative colitis

2.2 动物模型的构建

DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎模型显示,相同条件下RNF138-KO比RNF138-WT小鼠的临床评分更高(图2A),体质量下降更为显著(图2B),以及死亡率更高(图2C)。与对照组相比,RNF138-KO小鼠的结肠长度显著缩短,并表现出脾肿大(图2D,E)。在RNF138-KO小鼠中,IHC显示整个黏膜出现广泛炎性反应,淋巴细胞浸润增强,与上皮结构改变和隐窝丢失同时发生(图2F)。而在对照组小鼠中只发现了炎性病变。

A.clinical scores of RNF138-WT(n=6) and RNF138-KO mice (n=5) on the 9th day after DSS administration;B.body weight changes during chronic colitis with DSS treatment (RNF138-WT, n=10; RNF138-KO, n=7);C.Kaplan-Meier survival analysis of RNF138-WT (n=11) and RNF138-KO (n=20) mice during the course of DSS treatment;D.representative gross morphology and in mock and chronic colitis model mice;E.macroscopic appearance of colons of RNF138-WT and RNF138-KO mice (n=5) cohorts at the end of DSS treatment;F.representative HE images (left) and histological analysis (right) of colon tissues from RNF138-WT and RNF138-KO mice (n=7) after DSS administration; scale bar=500 μm;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with RNF138-WT group.图2 DSS诱导RNF138-WT和RNF138-KO小鼠溃疡性结肠炎模型Fig 2 DSS-induced ulcerative colitis model in RNF138-WT and RNF138-/- mice

2.3 RNF138与NF-κB相关性分析

利用生物信息学对RNF138-WT和RNF138-KO UC模型小鼠肠组织进行差异表达基因分析,发现两组在转录组水平上存在显著差异(图3A)。GO富集分析显示差异基因与肠上皮细胞分化、增殖、凋亡和细胞衰老有关(图3B)。差异基因的GO的信号通路分析显示上述功能变化靶向NF-κB信号通路(图3C)。蛋白质相互作用分析显示了NF-κB信号与不同功能元件相互连接的核心作用(图3D)。

A.heatmap depiction of differentially expressed genes in RNF138-WT and RNF138-KO colorectal cells;B.enrichment of gene ontology (GO) database of cell growth, apoptosis, cell cycle, differentiation and senescence;C.the top 10 significant signaling pathways in GO database;D.protein-protein interaction analysis of significant GO database in colitis.图3 RNF138-WT 和RNF138-KO UC组织的GO数据库分析Fig 3 GO database analysis of RNF138-WT and RNF138-KO UC-tissues

2.4 溃疡性结肠炎中敲除RNF138后p-p65表达上调

p-p65是NF-κB通路重要成员,模型小鼠结肠组织显示其在RNF138缺失后表达显著上调(图4 A),其下游基因CXCL1,PTGS2,ICAM-1和NF-кB1表达增加(图4 B),临床样本中溃疡性结肠炎患者结肠组织中RNF138表达下降而p-p65表达染色增强(图4C)。

A.p-p65 protein expression levels in the colon tissue of RNF138-KO and RNF138-WT;B.target gene of NF-κB mRNA expression in the colon tissue of RNF138-KO and RNF138-WT, *P<0.05; C.representative HE images in patient’s colon tissue.图4 溃疡性结肠炎中敲除RNF138后p-p65表达上调Fig 4 Upregulation of p-p65 expression after knockout of RNF138 in ulcerative colitis

3 讨论

本研究发现GEO数据库和临床样本中的溃疡性结肠炎患者体内RNF138表达下调,并在活动期表达下调显著。溃疡性结肠炎发病机制复杂,涉及遗传和环境因素,主要表现为免疫反应失调和上皮屏障缺陷,其中细胞因子对于疾病的发展和患者临床特征起着重要作用。目前多项研究证实RNF138在不同生理和病理环境中具有表达差异,并发现其与肿瘤发生、神经退行性疾病和慢性炎性反应有关,越来越多的证据表明RNF138具有复杂的功能[5-6],因此RNF138在溃疡性结肠炎中的作用更值得关注。本文还在DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型中发现RNF138敲除后小鼠死亡率增加,体质量变化增加,结肠变短脾脏肿大。病理组织显示RNF138敲除后炎性反应加重,这些发现与上述结果相吻合。通过对小鼠结肠组织进行整体水平的转录组分析,发现溃疡性结肠炎靶向NF-κB通路。

NF-κB家族由是由含Rel样结构域的5个相关的转录因子组成:p50、p52、p65、c-Rel和RelB。p65也被称为RelA[7], NF-κB信号具有经典途径和替代途径这两种激活方式,在替代途径中,IкB蛋白首先被IKKβ磷酸化,然后通过指定的E2或E3泛素连接酶泛素化,最终将NF-κB释放到细胞核中,开启靶基因的转录,因此当泛素酶表达异常时,NF-κB通路将受到异常调控影响靶基因的转录[8]。本文证明RNF138下调会导致p65磷酸化,RNA水平显示其下游基因NF-κB1, IκBα,CXCL1和ICAM-1表达的增加,总体上突出了NF-κB信号通路的增强激活。因此本研究发现在溃疡性结肠炎中RNF138表达下调,并且负向调控NF-κB信号通路,为溃疡性结肠炎研究提供新思路。