γ-氨基丁酸促进水疱性口炎病毒感染小鼠巨噬细胞

赵 璐，刘 洋

中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 1.生物化学与分子生物学系；2.免疫学系，北京 100005

病毒感染严重威胁人类的生命健康,寻找更加高效的治疗方案、研发相应的抗病毒药物具有重要的临床意义,也是亟待解决的热点问题。宿主细胞代谢与病毒感染息息相关,病毒感染能导致宿主细胞发生代谢重塑,而宿主细胞内代谢状态的变化也能反过来作用于病毒感染。已有研究证明了宿主细胞内的乳酸、琥珀酸、丝氨酸等多种代谢物在病毒感染后含量发生明显改变,并通过多种不同机制调节病毒感染及自身抗病毒天然免疫[1-4],进一步鉴定和探究调控病毒感染的新型宿主代谢物仍具重要意义。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种重要的抑制性神经递质,近年来越来越多的研究表明GABA在免疫系统也发挥重要作用。例如,B细胞产生的GABA具有免疫调节功能,能抑制抗肿瘤免疫反应[5]。GABA在水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)感染的小鼠骨髓来源巨噬细胞(mouse bone marrow-derived macrophages,BMDMs) 和SARS-CoV-2感染的Vero E6 TMPRSS2+细胞中会发生明显的上调[6-7],提示宿主细胞内GABA在病毒感染过程中可能扮演重要角色。因此,本研究旨在探究GABA在VSV感染小鼠巨噬细胞中的调控作用,为相关病毒感染性疾病的治疗提供可能的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:6～8 周SPF级C57BL/6小鼠(中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心)。

1.1.2 细胞及病毒:小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞(America Type Culture Collection,ATCC);VSV由第二军医大学潘卫教授赠予,并由本实验室扩增保存。

1.1.3 试剂:DMEM培养基(Corning公司);胎牛血清(Gibco公司);CCK-8试剂盒(Solarbio公司);GABA(MCE公司);总RNA提取试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司);反转录试剂盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒(上海东洋纺生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代腹腔巨噬细胞的获取和培养:给小鼠腹腔注射2 mL高压灭菌的3%羟乙基淀粉肉汤培养基,3～4 d后,抽取小鼠原代腹腔巨噬细胞,进行细胞计数,以5×105个细胞/mL接种于12孔细胞培养板中。在37 ℃,5% CO2细胞培养箱中培养2 h后更换培养基,继续培养过夜。第2天,将细胞换液,加入10、30、50和70 mmol/L GABA或PBS预处理细胞2 h,随后进行VSV感染(MOI=1),8 h后收集细胞。

1.2.2 CCK-8检测细胞活性:将RAW264.7细胞系以104个/孔接种于96孔细胞培养板中,在37 ℃,5% CO2细胞培养箱中培养过夜。第2天,将细胞换液,加入10、30、50和70 mmol/L GABA或PBS处理细胞。10 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,在细胞培养箱中孵育1 h后,使用酶标仪在450 nm波长下检测细胞吸光度值(A)。

1.2.3 荧光显微镜检测细胞内GFP-VSV水平:将RAW264.7细胞系经70 mmol/L GABA或PBS处理2 h,随后用表达GFP荧光标签的重组病毒GFP-VSV感染,8 h后用荧光显微镜直接观察细胞内的荧光强度。

1.2.4 流式细胞术检测细胞内GFP-VSV水平:将RAW264.7细胞系经30、50和70 mmol/L GABA或PBS处理2 h,随后用GFP-VSV感染,8 h后收集细胞,用PBS洗涤细胞1次,离心后将细胞沉淀重悬于0.5 mL PBS中,并转移至流式管,使用LSRFortessa流式细胞仪检测GFP阳性细胞比例及GFP荧光强度,使用FlowJo软件分析所得数据。

1.2.5 RT-qPCR检测细胞mRNA表达:收集的RAW264.7细胞系或小鼠原代腹腔巨噬细胞,利用总RNA提取试剂盒提取总RNA,用Nanodrop测量RNA的浓度,使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,随后使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix 试剂盒进行RT-qPCR检测。以Actb为内参,采用公式2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 GABA不影响细胞活性

用10、30、50和70 mmol/L GABA处理RAW264.7细胞系10 h,与对照组相比,细胞活性没有明显变化,即此剂量GABA不会造成对细胞的毒性(图1)。

The CCK8 assay was used to examine the viability of RAW264.7 cell line after treatment with the indicated dose of GABA for 10 hours.图1 不同剂量GABA对RAW264.7细胞系活性的影响Fig 1 The effect of different dose of GABA on the viability of RAW264.7 cell n=4)

2.2 GABA增强GFP-VSV感染RAW264.7细胞系中的荧光强度

用GABA预处理的RAW264.7细胞系在GFP-VSV感染8 h后, GFP阳性细胞比例及细胞内GFP荧光强度与对照组细胞相比显著增加,即GABA促进了GFP-VSV感染RAW264.7细胞系(图2A,B),且呈剂量依赖性(图2C)。

The levels of GFP-VSV in RAW264.7 cell line pre-treated with the indicated dose of GABA or PBS for 2 hours and infected with GFP-VSV for 8 hours were observed by fluorescence microscopy (A) and were detected by flow cytometry (B,C) (n=3);Scale bar=100 μm; MFI.mean fluorescence intensity; *P<0.05,**P< 0.01 compared with GABA 0 mmol/L group.图2 GABA对GFP-VSV感染RAW264.7细胞系中荧光强度的影响Fig 2 The effect of GABA on fluorescence intensity in RAW264.7 cell line infected with GFP-VSV

2.3 GABA提高VSV感染的RAW264.7细胞系中VSV mRNA水平

与对照组相比,GABA预处理的RAW264.7细胞系中VSV RNA水平明显增加,且呈剂量依赖性,即GABA以剂量依赖方式促进VSV 感染RAW264.7细胞系(图3)。

RT-qPCR analysis of VSV RNA in RAW264.7 cell line pre-treated with the indicated dose of GABA and then infected with VSV for 8 hours; *P< 0.01,**P< 0.001 compared with GABA 0 mmol/L group.图3 GABA对VSV感染的RAW264.7细胞系中VSV RNA水平的影响Fig 3 The effect of GABA on the level of VSV RNA in VSV-infected RAW264.7 n=4)

2.4 GABA提高 VSV感染的小鼠原代腹腔巨噬细胞中VSV RNA水平

与对照组相比,GABA预处理的小鼠原代腹腔巨噬细胞中VSV RNA水平明显增加,且呈剂量依赖性(图4)。

RT-qPCR analysis of VSV RNA in mouse primary peritoneal macrophages pre-treated with the indicated dose of GABA and then infected with VSV for 8 hours; *P<0.01, **P< 0.001 compared with GABA 0 mmol/L group.图4 GABA对VSV感染的小鼠原代腹腔巨噬细胞中VSV RNA水平的影响Fig 4 The effect of GABA on the level of VSV RNA in VSV-infected mouse primary peritoneal

2.5 GABA提高VSV感染的RAW264.7细胞系中细胞因子mRNA水平

用10、30、50和70 mmol/L GABA预处理的RAW264.7细胞系在VSV感染8 h后,Ifnb1和Il-6的mRNA表达水平与对照组细胞相比显著升高(图5)。

RT-qPCR analysis of mRNA levels of Ifnb1 and Il-6 in RAW264.7 cell line pre-treated with the indicated dose of GABA and then infected with VSV for 8 hours; *P<0.05 compared with 0 mmol/L GABA group.图5 GABA对VSV感染的RAW264.7细胞系中细胞因子mRNA水平的影响Fig 5 The effect of GABA on the mRNA levels of cytokine in VSV-infected RAW264.7 n=4)

3 讨论

近年来,全球范围内频繁爆发大规模的病毒感染,严重影响了人类生命健康,因此迫切需要探究更加安全高效的抗病毒策略。宿主细胞代谢与病毒感染关系尤为密切。病毒依赖于宿主细胞为其提供复制和繁殖所需的物质和能量,因此宿主细胞代谢水平和状态能直接影响病毒的复制周期;同时宿主细胞内发生改变的代谢物还能通过影响自身抗病毒天然免疫进而影响病毒感染和疾病进程[8]。寻找能够调控病毒感染的新型宿主代谢物有望为病毒感染性疾病的治疗提供新思路。已有文献报道在VSV和SARS-CoV-2感染的宿主细胞中,代谢物GABA含量会发生明显上调,提示GABA在病毒感染宿主细胞的过程当中可能发挥重要作用[6-7]。基于此,本研究探究了GABA在VSV感染过程中的调控作用。

本研究发现10、30、50和70 mmol/L GABA不影响细胞活性,且用此剂量的GABA预处理RAW264.7细胞系和小鼠原代腹腔巨噬细胞能显著促进VSV感染,并呈剂量依赖性,由此提示病毒感染所诱导的宿主细胞内GABA含量的上调可能起着有利于病毒自身生存复制的作用。天然免疫系统是机体防御病毒感染的第一道防线,其通过诱导IFN-I和炎性因子等一系列免疫分子的产生来抵抗病毒感染[9-11]。然而,在本研究中,GABA在促进病毒感染的同时,主要抗病毒细胞因子Ifnb1和Il-6的mRNA水平也升高,提示GABA促进病毒感染可能并非通过抑制抗病毒天然免疫细胞因子Ifnb1和Il-6的mRNA表达实现的。

综上所述,本研究表明GABA能以剂量依赖方式促进病毒感染小鼠巨噬细胞,因此抑制GABA的产生或降低其相关代谢通路的活性可能成为治疗相关病毒感染性疾病的潜在思路,然而GABA发挥促病毒作用的具体机制还需进一步的深入探究。