LncRNA CBR3-AS1在多发性骨髓瘤中的表达及临床意义

张永梅，张志敏，周 洁，潘志兰，冯丽倩，杨 彦

石家庄市人民医院 血液内科，河北 石家庄 050000

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是第二常见的血液系统恶性肿瘤,据统计其发病率约占血液系统恶性疾病的10%,主要影响中老年人,诊断时的中位年龄为65岁。该疾病的特征是骨髓中克隆性浆细胞异常扩增,血清或尿液中产生单克隆免疫球蛋白,导致相关器官损伤或衰竭[1]。随着医学科技水平的不断进步,MM的早期诊断和治疗手段取得了一定的进展,使得患者的总生存期获得延长,但仍然无法完全治愈[2]。因此,迫切需要了解MM的发病机制,有利于识别新的治疗靶点,用于临床检测和治疗。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,LncRNAs)是一种没有或几乎没有蛋白质编码能力的RNA,大量研究证实,LncRNAs通过调控致癌和肿瘤抑制的途径参与了大量的生物学过程[3]。近年来关于MM的研究显示,LncRNA的表达水平失调与骨髓瘤的发生发展、诊断治疗和预后密切相关[4]。长链非编码羰基还原酶3反义RNA1(LncRNA CBR3-AS1)是最近几年发现的LncRNA,已有研究证明其表达水平异常与多种恶性肿瘤的发生发展有关,如骨肉瘤、肝癌、乳腺癌等[5-7]。然而LncRNA CBR3-AS1在MM中的临床意义尚未阐明。因此,本研究检测了MM患者血清中LncRNA CBR3-AS1的表达水平,旨在阐明LncRNA CBR3-AS1表达与MM患者临床特征及预后的关系,为寻找新的临床诊断和治疗的潜在靶点提供参考。

1 材料与方法

1.1 资料

1.1.1 病例:纳入石家庄市人民医院2012年1月至2020年3月期间初诊的100例MM患者作为观察组,包括51例男性和49例女性,年龄均小于65岁,平均年龄为(49.3±10.5)岁。所有患者均符合2011年修订版的《中国多发性骨髓瘤诊疗指南》中的诊断标准[8],此前未进行过任何相关治疗,在初诊时进行血常规、血肌酐等临床指标检查,并根据检查结果进行传统分期系统(D-S)分期、国际分期系统(ISS)及RISS分期。合并严重的心血管疾病、肝脏疾病及其他严重的系统疾病者除外。另纳入50例65岁以下的健康体检人员作为对照组,包括29例男性,21例女性,平均年龄(47.8±9.9)岁,两组研究对象的性别和年龄没有差异。本研究方案得到石家庄市人民医院伦理委员会的批准(审批号:20110511)和所有研究对象的知情同意。

1.1.2 试剂:TRIzol试剂(北京天根生化科技有限公司);Prime Script RT Master Mix和SYBR PREMIX EX TAQTMⅡ试剂盒(TaKaRa公司);引物干粉(上海生工生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 血清的收集与保存:在开始治疗前,收集观察组患者及对照组研究对象清晨空腹状态下的静脉血5 mL,在4 ℃ 3 000×g离心10 min,取上层血清分装到干净的离心管中,一部分用于测定,一部分保存在-80 ℃备用。

1.2.2 RT-qPCR检测LncRNA CBR3-AS1表达:使用TRIzol试剂提取血清的总RNA,通过琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA的纯度和质量。然后根据反转录试剂盒说明书,使用Prime Script RT Master Mix反转录成cDNA,然后应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)法检测LncRNA CBR3-AS1表达水平。应用Primer5.0软件设计LncRNA CBR3-AS1定量引物,内参引物使用β-actin,引物序列为:LncRNA CBR3-AS1上游引物:5′-AGTAGTTGCTTGTCCTAT-3′,下游引物:5′-AAGTCAGTAAGTCCTAAGT-3′;β-actin上游引物:5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′,下游引物:5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。以cDNA为模板,使用SYBR PREMIX EX TAQTMⅡ试剂盒在ABI7500实时荧光检测系统上进行反应。具体操作按照试剂盒和仪器说明书的要求进行。

1.2.3 MM患者的临床分期标准:以D-S分期标准、ISS分期及RISS分期标准对MM进行临床分期。D-S分期、ISS分期标准参考2011年《中国多发性骨髓瘤诊疗指南》[8-9]。

1.2.4 随访:从患者出院日开始,通过门诊复查、电话问诊、短信查访等随访方式对其进行随访,随访内容为患者的生存状态,随访时间共18个月,最晚至2021年9月。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 观察组和对照组血清中LncRNA CBR3-AS1的相对表达

观察组血清中LncRNA CBR3-AS1的相对表达水平为4.26±1.03,显著高于对照组的1.00±0.00(P<0.05)。

2.2 血清LncRNA CBR3-AS1的相对表达水平与MM患者临床参数的关系

根据MM血清LncRNA CBR3-AS1相对表达水平分为50例LncRNA CBR3-AS1高表达组(3.53±0.56)和50例LncRNA CBR3-AS1低表达组(4.98±0.57)。血清中LncRNA CBR3-AS1的表达水平与D-S分期和ISS分期有关(P<0.05)(表1)。

表1 血清LncRNA CBR3-AS1的相对表达水平与MM患者临床参数的关系Table 1 Relationship between the relative expression levels of serum LncRNA CBR3-AS1 and the clinical parameters in patients with multiple myeloma

2.3 血清LncRNA CBR3-AS1的相对表达水平与MM患者预后的关系

100例MM患者18个月共生存68例,死亡32例,生存率为68.0%。其中,LncRNA CBR3-AS1高表达组生存29例,死亡21例,生存率为58.0%,低表达组生存39例,死亡11例,生存率为78.0%。LncRNA CBR3-AS1低表达组患者的生存率明显高于LncRNA CBR3-AS1高表达组的患者,血清LncRNA CBR3-AS1表达水平与患者的生存率紧密相关(χ2=5.370,P<0.05)(图1)。

图1 Kaplan-Meier生存曲线分析血清LncRNA CBR3-AS1的表达与MM患者预后的相关性Fig 1 Kaplan-Meier survival curve analyzed the correlation of serum LncRNA CBR3-AS1 expression and the prognosis of patients

2.4 单因素及多因素Cox回归分析影响MM患者预后的因素

临床D-S分期和ISS分期及血清LncRNA CBR3-AS1的表达影响MM患者的预后,而年龄、性别及疾病分型对MM患者的预后无明显影响;多因素Cox回归分析评估可能影响MM患者预后的因素,临床D-S分期和ISS分期及血清LncRNA CBR3-AS1的表达均可作为MM的独立影响因素(P<0.05)(表2,3)。

表2 单因素分析MM患者患者预后的因素Table 2 Univariate analysis of the prognostic factors in patients with multiple myeloma n=100)

表3 多因素Cox回归分析MM患者患者预后的因素Table 3 Multivariate Cox regression analyzed the prognostic factors in patients with multiple

3 讨论

在过去的十年里,随着MM治疗方法的增加,为患者带来更好的结果,然而,MM患者通常会出现复发,后续改善预后不良的治疗在异质性复发或难治性的患者群体中仍然是一大难题[10]。寻找新的分子标志物是当前的重中之重。

LncRNA具有促进或抑制肿瘤的发生与发展的作用,目前有许多的LncRNA在MM中被鉴定出具有功能性和临床价值,可能在发病机制中起重要作用,甚至作为治疗靶点,改善患者的预后[11]。大量研究证实LncRNA的失调与骨髓瘤的发生发展和预后不良密切相关,是影响患者生存率的独立预后因素[12-14]。

LncRNA CBR3-AS1是CBR3反义区域的一种新的IncRNA,以往的研究证实了它在各种癌中起致癌作用,敲低其表达能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,与临床病理特征密切相关[5-7, 15]。本研究中MM患者血清中LncRNA CBR3-AS1的表达水平显著上升,其表达水平与MM患者D-S分期、ISS分期有关。D-S分期、ISS分期是MM常见的临床分期,不同的分期采用不同的治疗策略。其中,D-S分期反映骨髓瘤细胞数量,随着疾病的持续进展,骨髓瘤细胞数量增加,开始出现临床症状;ISS分期主要用于判断预后。

血清LncRNA CBR3-AS1表达水平与MM患者预后相关,LncRNA CBR3-AS1高表达组的患者的生存率明显小于低表达组的患者。单因素分析结果显示,临床D-S分期和ISS分期及血清LncRNA CBR3-AS1影响MM患者的预后,多变量Cox回归分析结果表明D-S分期、ISS分期及血清LncRNACBR3-AS1是评估MM患者预后的独立影响因素。此前的研究也证实了LncRNA CBR3-AS1表达上调是多种肿瘤的独立不良预后因素[5-7]。以上说明LncRNA CBR3-AS1可能是MM患者有价值的预后标志物。