黄连生物碱改善小鼠原代肝细胞糖异生与脂质蓄积

颜家琦，王思齐，王 峥，李 隽

中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系，北京 100005

肝脏是全身代谢的关键器官[1],当肝脏功能受损时,可能引发胰岛素抵抗,进而导致2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)等代谢性疾病[2]。糖尿病患者的特征为血糖升高,其主要原因是糖异生作用增强。此外,肝脏脂质蓄积或脂质代谢紊乱会进一步干扰胰岛素敏感性,进而加重T2DM的发生[3]。在当今饮食方式和社会环境的影响下, T2DM全球发病率一直呈上升趋势,据估计,到2030年糖尿病患病率将增长至10.2%[4]。糖尿病人群的激增造成了国家医疗和经济的双重压力,且目前没有有效的临床治愈手段,因此探索治疗T2DM的有效方法成为一个亟待解决的科学问题。

黄连是一种传统中药,历代医书对于应用黄连治疗糖尿病有着大量的记载。现代药理研究表明,黄连具有多种治疗活性[6],包括抗菌消炎、抗病毒、降血糖、降血脂、降血压和抗氧化等作用[7]。黄连生物碱(coptis alkaloids, CA)是中药黄连的主要药理活性成分,目前对其治疗糖尿病的具体生物碱成分及作用机制尚不清楚。根据黄连样品HPLC图谱分析可知,黄连生物碱中主要单体成分包括小檗碱(Ber)、表小檗碱(Epiber)、黄连碱(Cop)、巴马汀(Palm)、药根碱(Jateo)、非洲防己碱(Colum)和木兰花碱(Magno)7 种[8]。本研究使用小鼠原代肝细胞建立糖异生模型与脂质蓄积模型,筛选能改善小鼠原代肝细胞糖异生与脂质蓄积的黄连生物碱单体成分,并探讨其作用机制,为其用于防治代谢性疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂:黄连总生物碱、黄连碱、小檗碱、表小檗碱、巴马汀、药根碱、非洲防己碱、木兰花碱(成都曼斯特生物科技公司);DMEM培养基(Corning公司);胎牛血清(Gibco公司);Ⅳ型胶原酶(Sigma公司);CCK-8试剂盒(北京聚地安泰科技有限公司);葡萄糖检测试剂盒(碧云天公司);Trizol、反转录试剂盒和实时定量PCR反应预混液(南京诺唯赞公司);考马斯亮蓝G250(北京索莱宝科技有限公司);GAPDH抗体(Millipore公司);p-AKT、AKT、FAS、PPARγ抗体(CST公司);PLIN1抗体(Abclonal公司);山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(北京中杉金桥公司)。

1.1.2 溶液配方:缓冲液Ⅰ(142 mmol/L氯化钠,6.7 mmol/L氯化钾,10 mmol/L HEPES, 0.95 g/L EGTA,pH 7.4);缓冲液Ⅱ(66.7 mmol/L氯化钠,6.7 mmol/L氯化钾,100 mmol/L HEPES,4.8 mmol/L二水氯化钙,0.5 g/L Ⅳ型胶原酶,4.2 g/L FFA-free BAS,pH 7.6);缓冲液Ⅲ(90% Percoll,10% PBS,10 mmol/L HEPES,pH 7.4±0.2)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代肝细胞的提取:给小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉,分别使用缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ进行肝脏灌流。摘取肝脏放入含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,在超净台内快速抖落细胞,并将细胞悬液通过70 μm细胞筛。4 ℃、800 r/min 离心4 min,使用含7 mL缓冲液Ⅲ和8 mL培养基的混合液重悬细胞。4 ℃、1300 r/min离心5 min,用10 mL培养基重悬细胞,计数后接种至孔板中,4～6 h后换液。

1.2.2 CCK-8法测定细胞存活率:小鼠原代肝细胞贴壁换液后,分别加入0.5、1、2、5、10 μg/mL黄连总生物碱,或2.5、5、10、20 μmol/L单体成分处理24 h。弃掉上清,每孔加入90 μL细胞培养基和10 μL CCK-8的混合液,37 ℃避光孵育1 h,然后用酶标仪测定450 nm处的吸光度。以对照组细胞的细胞存活率为100%,计算各实验组的细胞存活率。

1.2.3 葡萄糖生成量的检测:用低糖DMEM饥饿小鼠原代肝细胞3 h,换为无糖无酚红DMEM。给药组加入0.5、1、2 μg/mL黄连总生物碱,对照组与模型组加入等量DMSO。给药1 h后,给药组与模型组加入丙酮酸钠(2 mmol/L)、乳酸钠(20 mmol/L)以及胰高血糖素(100 nmol/L)。6 h后取上清,用葡萄糖检测试剂盒(O-toluidine法)测定培养基中葡萄糖含量。收取细胞,裂解后测定蛋白含量,以校正葡萄糖含量。

1.2.4 实时定量PCR检测糖异生相关基因mRNA表达水平:收集各组细胞样品,采用Trizol法提取总RNA,利用Nanodrop Lite超微量分光光度计进行定量,取1 μg总RNA按反转录试剂盒说明书合成cDNA。以PPIA为内参基因,利用SYRB Green法进行real-time qPCR检测,计算目的基因的相对表达量。各目的基因的上下游引物如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primers sequence for RT-qPCR

1.2.5 Western blot检测蛋白表达水平:收集各组细胞样品,加入Triton-X 100裂解液,4 ℃裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min离心10 min,取上清至离心管中,蛋白定量后加入上样缓冲液混匀,95 ℃加热5 min使蛋白变性,进行SDS-PAGE电泳。PVDF膜转印后,将膜放入5%脱脂牛奶中室温封闭1 h,之后再加入一抗于4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后,加入二抗室温孵育1 h,使用ECL化学发光液显影并分析结果。

1.2.6 油红O染色:给药组加入0.5、1、2 μg/mL黄连总生物碱,对照组与模型组加入等量DMSO。给药1 h后,给药组与模型组加入棕榈酸(0.5 mmol/L)和油酸(1 mmol/L)。48 h后弃去培养基,PBS清洗后用4%多聚甲醛室温固定20～30 min。提前按照油红O∶蒸馏水=3∶2配制油红O工作液,过滤后使用(油红O工作液应现用现配)。弃去固定液后加入PBS清洗,吸干PBS,加入油红O工作液,于室温摇床上避光染色30 min。弃去染色液,PBS冲洗1遍,用60 %异丙醇冲洗2次,PBS清洗1次,干燥后拍照。每孔加入1 mL异丙醇将油红O充分溶解,吸取100 μL加入黑色透明底96孔板中,使用酶标仪测定510 nm处的吸光度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 黄连总生物碱抑制胰高血糖素诱导的小鼠原代肝细胞糖异生

黄连总生物碱浓度为0.5、1、2 μg/mL时,小鼠原代肝细胞的细胞存活率在80%以上(图1A),选用该剂量进行后续研究。糖异生模型组的葡萄糖生成量显著高于对照组(P<0.001),且糖异生相关基因G6PC与PCX的mRNA表达水平也明显高于对照组(P<0.05),使用黄连总生物碱处理后,葡萄糖生成量以及G6PC与PCX的mRNA表达水平均显著低于模型组(P<0.05)(图1B,C)。

A.detection of cytotoxicity of coptis alkaloids in mouse primary hepatocytes; B.coptis alkaloids decreased glucose production; C.coptis alkaloids decreased G6PC and PCX mRNA levels; *P<0.05, **P<0.001 compared with control group; #P<0.05, ##P<0.001 compared with model group; C.control; M.model; CA.coptis alkaloids.图1 黄连总生物碱对小鼠原代肝细胞的葡萄糖生成以及G6PC、PCX mRNA水平的影响Fig 1 Effects of coptis alkaloids on glucose production and G6PC, PCX mRNA levels in mouse primary

图2 黄连生物碱单体成分对小鼠原代肝细胞中细胞存活率的影响Fig 2 Effects of coptis chinensis monomer on cell viability in mouse primary hepatocytes n=3)

2.2 不同剂量的黄连生物碱单体成分在小鼠原代肝细胞中的细胞存活率检测

黄连碱与小檗碱浓度为2.5、5 μmol/L,表小檗碱、巴马汀、药根碱、非洲防己碱、木兰花碱浓度为2.5～20 μmol/L时,小鼠原代肝细胞的细胞存活率在80%以上,选用相应药物剂量进行后续研究。

2.3 小檗碱是有效抑制小鼠原代肝细胞糖异生的黄连生物碱单体成分

糖异生模型组的葡萄糖生成量显著高于对照组(P<0.05),使用小檗碱处理后,葡萄糖生成量显著低于模型组(P<0.05),其他单体药物没有降低小鼠原代肝细胞葡萄糖生成的作用(图3A)。模型组糖异生相关基因G6PC与PCX的mRNA水平明显高于对照组(P<0.05),使用小檗碱处理后,G6PC与PCX的mRNA水平均显著低于模型组(P<0.05)(图3B)。胰高血糖素可导致AKT的磷酸化水平下调(P<0.05),不同剂量的小檗碱处理后,可以有效上调AKT的磷酸化水平(P<0.05)(图3C)。

A.glucose production after treated with 7 types of coptis chinensis monomers for 6 hours; B.berberine decreased G6PC and PCX mRNA levels; C.berberine increased protein level of p-AKT;*P<0.05, **P<0.01 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; C.control; M.model.图3 黄连生物碱单体成分对小鼠原代肝细胞糖异生的影响Fig 3 Effects of coptis chinensis monomer on gluconeogenesis in mouse primary hepatocytes n=3)

2.4 黄连总生物碱减少棕榈酸与油酸诱导的小鼠原代肝细胞脂质蓄积

脂质蓄积模型组的红色脂滴较对照组明显增多(P<0.01),使用黄连总生物碱处理后,小鼠原代肝细胞中红色脂滴的含量随着药物剂量的增加呈现逐渐减少的趋势,且与模型组相比脂滴变小,颜色变浅(P<0.01)(图4A,B)。棕榈酸与油酸处理可导致FAS、PLIN1的蛋白水平较对照组上调(P<0.01),不同剂量的黄连总生物碱处理后,可以剂量依赖性地下调FAS、PLIN1的蛋白水平(P<0.01)(图4C)。

A.Oil red O staining of primary hepatocytes after treated with coptis alkaloids for 48 hours; B.quantification of oil red O staining; C.coptis alkaloids decreased protein level of FAS and PLIN1; *P<0.01 compared with control group; #P<0.01, ##P<0.001, ###P<0.0001 compared with model group.C.control; M.model; CA.coptis alkaloids.图4 黄连总生物碱对小鼠原代肝细胞脂质蓄积的影响Fig 4 Effect of coptis alkaloids on lipid accumulation in mouse primary hepatocytes n=3)

2.5 黄连碱与小檗碱是有效抑制小鼠原代肝细胞脂质积累的黄连生物碱单体成分

脂质蓄积模型组的脂质含量较对照组明显增多(P<0.01),使用黄连碱与小檗碱处理后,小鼠原代肝细胞中脂质含量随着药物剂量的增加呈现逐渐减少的趋势(P<0.05),其他单体成分没有减少小鼠原代肝细胞脂质蓄积的作用(图5A)。棕榈酸与油酸处理可以导致FAS、PLIN1、PPARγ的蛋白水平较对照组增加(P<0.01),不同剂量的黄连碱与小檗碱处理后,可以剂量依赖性地下调FAS、PLIN1、PPARγ的蛋白水平(P<0.05)(图5B)。

A.quantification of oil red O staining after treated with 7 types of coptis chinensis monomers for 48 hours; B.coptisine and berberine decreased protein level of FAS, PLIN1, PPARγ; *P<0.01 compared with control group; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 compared with model group.C.control; M.model.图5 黄连生物碱单体成分对小鼠原代肝细胞脂质蓄积的影响Fig 5 Effect of coptis chinensis monomer on lipid accumulation in mouse primary hepatocytes n=3)

3 讨论

肝脏是机体代谢的主要器官,原代肝细胞是体内肝细胞的良好代表,新分离的肝细胞比肝脏来源的细胞系更能反映正常肝脏在体内的功能[9]。因此本研究使用小鼠原代肝细胞构建糖异生模型与脂质蓄积模型,用于后续研究。使用胰高血糖素处理是构建糖异生模型的常见方法[9],在本研究中,胰高血糖素同样可以升高小鼠原代肝细胞的葡萄糖生成,以及糖异生相关基因G6PC与PCX的mRNA表达水平,表明糖异生模型构建成功,为进一步筛选改善糖异生的黄连生物碱单体成分及探讨其作用机制奠定了良好基础。

黄连作为一种应用广泛的中药材,在治疗糖尿病和NAFLD等代谢性疾病中发挥了重要作用,但其调节糖脂代谢的具体药效成分及其作用机制尚不明确。本研究发现,小檗碱可以抑制糖异生模型组的葡萄糖生成,同时降低G6PC与PCX的mRNA水平,进一步研究表明小檗碱通过上调AKT的磷酸化水平,从而降低小鼠原代肝细胞糖异生。此外,肝脏中脂质代谢紊乱会加重T2DM的发生,肝脏脂质蓄积严重可能导致非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH),甚至造成肝硬化和肝细胞癌,对人们的生命健康造成极大威胁[10-11]。本研究使用油酸与棕榈酸构建小鼠原代肝细胞脂质蓄积模型,结果证实模型组细胞中的脂质含量较对照组明显增加,表明脂质蓄积模型构建成功;使用黄连碱与小檗碱处理后,小鼠原代肝细胞的脂质含量较模型组减少,且FAS、PLIN1、PPARγ的蛋白水平降低,表明黄连碱与小檗碱可以有效降低小鼠原代肝细胞的脂质蓄积。

综上所述,本研究构建了小鼠原代肝细胞糖异生模型与脂质蓄积模型,并成功筛选到能抑制原代肝细胞糖异生与脂质蓄积的黄连生物碱单体成分。其中小檗碱通过调节AKT磷酸化水平从而降低小鼠原代肝细胞糖异生,此外,黄连碱与小檗碱可抑制FAS、PLIN1、PPARγ等脂质生成相关蛋白的表达,进而减少小鼠原代肝细胞的脂质蓄积,提示小檗碱与黄连碱在代谢性疾病的防治中具有良好的应用前景。