乌梅水提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

2023-06-04刘明雨邢扬帆

黑龙江科学 2023年8期

臧蕾,刘明雨,邢扬帆,李振

(临沂大学医学院,山东临沂 276000)

金黄色葡萄球菌(SA)是临床上常见的致病菌,广泛存在于自然界中,是医院和社区感染致病的重要病原菌[1],随着抗菌药物的广泛使用,致使耐药菌菌株数量渐增。而化学合成药物研发难度大,时间长,毒副作用明显,故从中草药中获取抗菌物质、提高机体抗病力成为研究热点。

乌梅是蔷薇科植物梅的用药部分[2],研究发现其含有有机酸、萜类、脂类、黄酮[2]等多种有效成分,具有抑菌[3]、抗炎、抗氧化、增强免疫和降血糖等作用[4]。探讨乌梅水提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性及作用机制,可为其开发及临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

高速中药粉碎机(浙江哈瑞工贸有限公司生产)、分光光度计(上海元析仪器有限公司生产)、旋转蒸发器(上海贝茵生物科技有限公司生产)、台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司有限公司生产)、电子天平(沈阳龙腾电子有限公司生产)、高压灭菌锅(浙江新丰医疗器械有限公司生产)、电热套(常州润华电器有限公司生产)、SW-CJ-1D 超净工作台(苏州精华设备总厂生产)、生化培养箱(常州欣耀宇仪器制造有限公司生产)、酶标仪(济南好来宝医疗器械有限公司生产)、超纯水机(杭州亿捷科技有限公司生产)、电热恒温鼓风干燥箱(鹤壁市冶金机械设备有限公司生产)。

1.2 药物与试剂

乌梅(山东老百姓大药房提供)、营养琼脂培养基及营养肉汤培养基(青岛高科学海博生物技术有限公司生产)、碱性磷酸酶(ATP)试剂盒与乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒及蛋白定量测定试剂盒(上海嘉楚生物工程有限公司生产)、磷酸氢二钠与氯化钾(天津市鑫铂特化工有限公司生产)。

1.3 菌种

金黄色葡萄球菌(中国药品检验研究院生产)。

1.4 方法

1.4.1 乌梅提取物的制备

取20 g乌梅粉置于500 mL烧瓶,加入200 mL蒸馏水,浸泡0.5 h,煮沸回流1.5 h,过滤,制得提取液。滤渣,再加蒸馏水100 mL,再次煮沸回流45 min并过滤,合并提取液,浓缩,4 ℃保存,备用[5]。

1.4.2 药敏试验

采用管碟法,取融化的营养琼脂培养基适量,置培养皿中静置3～5 min,凝固后每个培养皿中加入107CFU/mL的SA菌悬液适量,用L型玻璃棒涂抹均匀,放置于5个牛津杯。将不同浓度乌梅提取液(50、25、12.5 mg/mL)、青霉素(阳性对照)、生理盐水(阴性对照)按250 μL/个加入牛津杯,放置在生化培养箱中,37 ℃恒温培养18～24 h,测量抑菌圈直径(IZD,mm),进行结果判定。IZD≥20 mm,极度敏感;15≤IZD<20 mm,高度敏感;10≤IZD<15 mm,中度敏感;5≤IZD<10 mm,轻度敏感;IZD<5 mm,不敏感[6]。

1.4.3 最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定

利用试管二倍稀释法,取9支干燥无菌试管,各加入1 mL含107CFU/mL的SA菌悬液。第1管加入0.4 g/mL的乌梅提取液1 mL,混匀,吸出1 mL加至第2管中,顺次操作至第7管,混匀,吸取1 mL弃去。第8管加入青霉素1 mL,为阳性对照管。第9管加入生理盐水1 mL,为阴性对照管。置于37 ℃恒温培养16～24 h,以无SA生长的试管所在的药物浓度认定为最小抑菌浓度(MIC)。将未见细菌生长的试管摇匀,分别吸取100 μL加入到营养琼脂培养基上,置生化培养箱内,37 ℃培养18～24 h,观察细菌生长状况,计算平板上的SA菌落,以活菌计数法表示平均菌落数,<5个对应的最小稀释度的提取物质量浓度即最小杀菌浓度(MBC)[6-7]。

1.4.4 乌梅水提取物抑菌机制研究

1)乌梅水提取物对金黄色葡萄球菌碱性磷酸酶的影响[8]。准备LB液体培养基,分别加入乌梅水提取物,使其浓度分别为MIC和2MIC。以不含乌梅水提取物的培养基作为对照,分别加入SA菌悬液,37 ℃、150 r/min摇床继续培养,于0、2、4、6、8 h时吸取菌液,3 500 r/min离心10 min,取上清液,用试剂盒测定AKP活性。

2)乌梅水提取物对金黄色葡萄球菌乳酸脱氢酶活性的影响[9]。分别于0、2、4、6、8 h时取实验组与对照组SA菌悬液,3 500 r/min离心5 min,取上清液,用试剂盒测定胞外LDH活性。

3)乌梅提取物对金黄色葡萄球菌胞外蛋白的影响。分别于0、2、4、6、8 h时取试验组与对照组SA菌悬液,3 500 r/min离心5 min,取上清液,加入考马斯亮蓝染色剂,静置5 min,用酶标仪测定595 nm波长处吸光度。

2 实验结果

2.1 乌梅水提取物抑菌效果

2.1.1 药敏试验

从表1可知,乌梅水提取物可明显抑制SA。浓度分别为12.5、25、50 mg/mL时,抑菌圈直径分别为17.50±0.94、20.11±1.03、22.82±0.88 mm,阳性对照,抑菌圈直径为15.34±1.26 mm,阴性对照,无抑菌现象,说明金黄色葡萄球菌对乌梅水提取物高度敏感。

表1 乌梅水提取物抑菌直径Tab.1 Bacteriostatic diameter of plum extract

2.1.2 对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC

MIC和MBC能够直观反映抑制细菌生长的最低浓度。由表2可知,乌梅提取物对SA的MIC和MBC分别为6.25 mg/mL、12.5 mg/mL,阴性对照组菌体生长良好。

表2 乌梅提取物对SA的MIC、MBC测定结果Tab.2 Determination results of MIC and MBC of plum extract against Staphylococcus aureus

2.2 乌梅水提取物抑菌作用机制

2.2.1 对金黄色葡萄球菌碱性磷酸酶的影响

乌梅水提取物对SA碱性磷酸酶(AKP)的影响结果见图1。随着处理时间的增加,经过MIC和2MIC乌梅水提取物处理后,菌悬液中AKP含量持续升高,在6 h后趋于平稳。2MIC乌梅提取物处理的SA菌悬液AKP含量超过MIC,表明乌梅水提取物可破坏SA细胞壁,从而使AKP含量增加[10]。

图1 乌梅水提取物对SA碱性磷酸酶的影响Fig.1 Effect of plum extract on alkaline phosphatase of Staphylococcus aureus

2.2.2 对金黄色葡萄球菌乳酸脱氢酶的影响

乌梅水提取物对SA乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响结果见图2。随着处理时间的增长,乌梅水提物处理菌液中LDH活性不断增强,2 MIC组乌梅提取物处理的SA菌悬液LDH活性高于MIC组,说明乌梅提取物的处理使SA细胞膜通透性增加,导致LDH含量增加。

图2 乌梅提取物对SA乳酸脱氢酶的影响Fig.2 Effect of plum extract on lactic dehydrogenase of Staphylococcus aureus

2.2.3 对金黄色葡萄球菌胞外蛋白的影响

乌梅水提取物对SA胞外蛋白的影响如3图所示。随着处理时间的增加,胞外蛋白浓度逐渐增加,其中2MIC乌梅水提取物处理的SA菌悬液胞外蛋白含量高于MIC,表明乌梅水提取物可增加SA的细胞膜通透性,造成细菌蛋白质外泄,从而引起菌体胞外蛋白含量的增加。

图3 乌梅水提取物对SA胞外蛋白的影响Fig.3 Effect of plum extract on extracellular protein of Staphylococcus aureus

3 讨论

通过宿主细胞内的支撑和保护,金黄色葡萄球菌可以逃避宿主防御机制和大多传统的抗菌药物治疗[11]。研究表明,乌梅提取物浓度分别为12.5、25 mg/mL时,对SA分别达到高度敏感和极度敏感状态,MIC、MBC分别为6.25 mg/mL和12.5 mg/mL,表现出良好的抑菌作用。AKP位于SA细菌细胞壁和细胞膜间隙中,一般不向外分泌,当SA细胞壁遭到破坏,AKP才会进入胞液中,因此细胞外AKP含量变化可表明细菌细胞壁的完好性[8]。细胞膜是细菌的保护屏障,当乌梅水提取物作用SA后,细胞膜通透性增加,细胞浆内的LDH、可溶性蛋白质可释放到培养液中[12],因此LDH水平、可溶性蛋白质含量的变化可间接反映细菌细胞膜的通透性。