硅藻纳米止血材料的研究进展

宋蕴琦,王寅初,王绪敏

(1.烟台生命科学学院,山东 烟台 264005; 2.中国科学院烟台海岸带研究所,山东 烟台 264003; 3.国家基础学科公共科学数据中心,北京 100190)

人体有一套完善的凝血途径,但在突发情况下很难及时有效地完成止血。传统的止血方法如烧灼术、人工按压和伤口缝合等,但有时却无法有效地控制出血,还需要止血材料的配合使用。临床上的止血产品大多为止血带、绷带和纱布等[1],通过压迫血管、阻断血运止血,这是处理四肢大出血时简单、有效的方法,但若使用不当或使用时间过长,可造成远端肢体缺血、坏死[2]。常见的止血材料有以下几种类型:①无机盐类止血材料,如沸石类止血剂、黏土类止血剂。这些制剂具有“分子筛”特性,能够吸附水,将各种凝血因子、血小板及红细胞集中在损伤部位,可迅速止血,但是也容易形成血栓,尤其是沸石类止血材料,容易烧伤组织[3]。②生物制品止血材料,如胶原和明胶类、凝血酶类、纤维蛋白类,具有激活凝血级联的潜能及良好的生物可降解性,可被人体吸收,可用作体内止血剂。但是胶原类价格较高,如牛胶原蛋白源自牛是一种强效过敏原,胶原容易粘在手套仪器上,不易去除,且难以在泌尿外科或眼科手术中使用,应用范围有限[4-5]。明胶类在小空间内使用时会过度膨胀,容易造成损伤或形成脓肿,促进细菌生长,干扰皮肤边缘的愈合[6],不能用于血管内。凝血酶类与纤维蛋白类保存条件较高。③多糖类止血材料,如壳聚糖类、纤维素、淀粉、葡聚糖类等。其可通过化学或物理方法改性,材料制作工艺烦琐,价格较高。材料未浸透组织时,粉末状的材料可能会堵塞血液,从而导致血栓[7]。

1 纳米止血材料

纳米技术是利用特殊的微观结构,使纳米材料得到改善,优化其扩散性、溶解性及生物相容性、大表面积及药物缓释性。近年来,取得较好发展的纳米止血材料主要有脂质体、纳米粒、自组装纳米肽及纳米纤维(见表1)。

表1 纳米止血材料的主要种类Tab.1 Main types of nano hemostatic materials

除了以上纳米材料,硅藻硅壳作为一种结构独特的新材料具有高度的结构精细度[12]。二氧化硅硅藻作为一种非细胞毒性、非免疫原性及廉价的止血剂被引入,能够克服常用止血材料的缺点。硅藻是一种单细胞光合藻类,外壳由多孔生物矿化硅组成,具有高度有序的分级结构,被认为是一个活的纳米结构工厂[13]。目前,硅藻生物硅的应用已达到纳米水平,通过不同方法可对其进行改善,利用价值不断提升。

2 硅藻介孔硅的材料学特性

介孔硅是一种孔径为2～50 nm的二氧化硅材料,具有较大的比表面积及孔容、良好的生物相容性、可控的孔径及有序可调的孔道结构[14]。由于介孔硅具有独特的生物降解性与生物相容性,在硅藻中获得生物二氧化硅之前,已有大量的实验利用其控制出血[15]。有报道称,介孔生物二氧化硅可通过聚集红细胞和血小板,激活凝血级联,迅速促进止血过程[16]。文献[17]表明,负电荷对于激活凝血级联的内在途径至关重要。硅醇等官能团的活性反应位点,令血清中相对酶凝血因子XII可能在凝血活性中较为关键[18]。但介孔硅材料合成技术的制备工艺复杂、能耗高,而纳米结构二氧化硅可从自然或生物资源中获得,加工成本大大减少。硅藻是单细胞的光合藻类,被包裹在“锥状体”多孔三维纳米的二氧化硅外壳中。硅藻和硅藻土中的生物纳米多孔二氧化硅构成了一种可用于生物医学的大型、低成本的介孔纳米器件储层。硅藻具有物种特异性及高度有序的孔隙结构、层次化的孔隙组织及优良的表面润湿性[19]。研究表明,天然硅藻壳表面的极性硅醇基团由于带负电荷,能有效促进血液凝固[18,20-21]。通过简单的酸处理或高温焙烧处理[22],可得到大量多孔生物硅,无需使用有毒试剂,也无需复杂的合成过程,保证了生物硅的使用安全性。在电镜下可直观看到硅藻外壳有许多小孔,这些小孔可负载不同功能的材料,在止血的同时还可增加药物缓释,是不同需求止血材料的良好载体。不同种的硅藻在显微镜下形态各异,但其结构上都带有纳米级别的小孔,这种中空且内部空间大的孔隙结构增加了与血液结合的表面积,可吸收更多的液体,如图1～图4所示。

图1 Psammodictyon sp.的扫描电子显微镜图像Fig.1 Scanning electron microscope image of Psammodictyon sp.

图2 Parlibellus harffiana的扫描电子显微镜图像Fig.2 Scanning electron microscope image of Parlibellus Harffiana

图3 Navicula sp.的扫描电子显微镜图像Fig.3 Scanning electron microscope image of Navicula sp.

图4 Navicula cf. perminuta的扫描电子显微镜图像Fig.4 Scanning electron microscope image of Navicula cf. Perminuta

硅藻除了本身的结构特征外,还有利于凝血。①良好的生物相容性。Stefano Managò[23]通过拉曼成像,研究了硅藻土(DNPs)中获得的多孔生物二氧化硅纳米颗粒与人肺表皮样癌细胞(H1355)共孵卵72 h,DNPs存活可达72 h且不会损害细胞活力或形态。②超亲水性和超亲血性。Jeehee[24]等使用由Melosiranummuloidese制备的硅藻硅石发现,硅藻果形的血液接触角(t=0 s时69.55±8.95)在10 s后接近0。接触角的测量是最有力的技术之一,可阐明单一的最顶层固体和液体的相互作用,从而证明硅藻介孔硅具有超亲水性[24]。利用红外光谱(FTIR)实验进一步证实了硅藻中含有丰富的硅醇基团,硅藻微球最外层的二氧化硅层表现出较强的阴离子电荷,血清蛋白通过电荷桥接机制与硅藻表面的高度阴离子紧密结合,表现出硅藻生物硅具有超亲血性。这些特殊的物理化学性质加强了生物硅的止血作用。

3 硅藻生物硅的止血应用

目前,生物硅作为止血材料的应用有很多。有学者通过反复实验验证了其物理化学性质,利用动物对其溶血性、凝血性、细胞毒性、在体内体外的止血效果构建出血模型,以开发出不同的止血材料。Feng[21]等证实了硅藻(Coscinodiscussp.)生物二氧化硅在止血方面的有效性,通过鼠尾截肢实验发现,硅藻的凝血时间(160.78±28.56 s)远短于纱布的凝血时间(510.26±63.22 s)。Wang[18]等研究了Thalassiosiraweissflogii、Thalassiosirasp.和Cyclotellacryptica的止血效果,通过强酸洗涤纯化硅藻获得纯净外壳,结果表明,硅藻具有优良的止血效果和良好的生物相容性及较低的细胞毒性。复杂的结构使其具有最高的BET比表面积及液体吸收性能,在体外和体内均表现出优异的止血能力。通过测试不同的硅藻发现,尺寸越小,凝血因子与材料之间的界面反应越强,因此细胞大小与液体吸收能力对止血效果有显著影响,测得T. weissflogii在体外凝血中表现出最短的止血时间为(158±8.19 s)[18]。Yanqing Luo[25]通过显微镜和结构表征观察到硅藻(Naviculaaustraloshetlandicasp.)有特殊的有序多孔网(6～8 nm)亚结构及表面积(401.45 m2/g-1),低溶血率(<1.55±0.06%)表明其具有良好的血液相容性。与壳聚糖相比,壳聚糖的凝血时间短(134.99±7.00 s)是因为其表面含有丰富的羟基官能团[25]。Naviculaaustraloshetlandicasp.是一种有前途的可持续生物硅来源。硅藻外壳表面的硅醇基团虽然可能引起溶血活性,但适当的化学表面修饰可以屏蔽-OH的暴露,为所需的官能团、蛋白质及分子提供锚定,还可以与养殖废水共同栽培,用于生产医疗止血材料。

为了提高止血性能,对硅藻壳进行了各种改性,将硅藻壳与凝血因子结合应用于凝血途径中。Li[20]等制备了硅藻颗粒,与凝血因子中的重要成分钙杂交,在大鼠断尾模型中,固有的凝血通路通过富含硅醇基团和钙的生物硅钙的独特界面,得到明显强化,使出血得到快速控制,Ca-biosilica的凝血时间为88.34±28.54 s[20]。Mu[26]利用聚多巴胺层作为连接体,将凝血酶固定在硅藻生物硅表面,制备了一种高效的复合止血材料(DA-diatom-T),保留了硅藻的多孔结构,使其具有具良好的吸水性,可吸收自身重量31倍的水,凝血酶活性高达5.81 U/mg,室温下30 d内可维持在67%。DA-diatom-T对小鼠成纤维细胞没有毒害作用,具有良好的血液相容性及快速促凝的能力,可促进凝血过程的启动,增加血小板活性与血凝块强度,在伤口处形成物理屏障。在体内研究中,DA-diatom-T可显著缩短凝血时间,减少出血量[26]。

还有学者将硅藻与壳聚糖进行复合,得到了一些成果。Li和Han等用壳聚糖包被硅藻壳[21],优化后制备的壳聚糖-硅藻不仅能快速有效地吸附液体,还能诱导红细胞的吸附和聚集。壳聚糖包被的硅藻在10 mg/mL下的最短凝固时间为248±32.42 s,比同等浓度下的裸硅藻短250 s,其外壳可显著激活凝血级联的内在途径,促进血液凝血,实现体内外出血控制。Zhang[27]研究了一种基于羟基丁基壳聚糖(HBC)与硅藻生物硅(DB)的出血控制复合海绵(H-D),它呈分层多孔结构,具有良好的生物相容性(溶血率<5%),无细胞毒性,液体吸收速度快(是本身的11～16倍),具有有效的止血作用。实验表明,H-D能提供较强的界面效应,诱导红细胞吸收聚集,激活凝血内在途径,从而加速凝血[27]。Sun[28]将烷基化壳聚糖(AC)与硅藻生物硅(DB)联合,开发了安全有效的止血复合海绵(AC-DB海绵),用于出血控制。AC-DB海绵由于具有促凝剂的化学结构,在体外表现出快速的止血能力,具有良好的生物相容性(溶血率<5%),没有细胞毒性,其与血液之间强烈的界面效应引起红细胞及血小板的活化、变形与聚集、凝血固有途径的激活,令凝血显著加速。它还具有良好的体内评估性能,具有最短的凝血时间(106.2 s)和最小的失血量(328.5 mg)[28]。

利用硅藻的多孔性质,与其他止血因子联合,可使凝血时间缩短,减少失血对机体的伤害。实验结果表明,硅藻止血材料的止血效果较好,能快速吸收血浆,增加血细胞与血小板浓度,激活固有的凝血途径,在体外对细胞无明显的细胞毒性,具有良好的血液相容性。

4 结束语

目前,市面上还没有理想的止血剂,需不断改进皮肤及血管止血剂。硅藻具有独特的3D二氧化硅结构,是新一代生物材料研究的重点,其性能是合成多孔二氧化硅材料无法实现的。硅藻壳具有独特的高比表面积分级多孔结构与可定制的表面改性及高生物相容性、化学稳定性,已成为一种新型、低成本的生物医学支架。虽然硅藻二氧化硅材料已被EPA、USDA及FDA批准用于食品工业与农业,但是其作为药物添加剂与载体还没有得到批准。研究表明,硅藻二氧化硅具有良好的生物相容性及较低的细胞毒性,在生物医学应用中具有巨大的潜力。