侗药黄蜡果不同部位总皂苷含量的测定

舒良银,易思雷,舒 琴,张小强,金 苹,唐根云,2,3

(1.湖南医药学院,湖南 怀化 418000; 2.侗医药研究湖南省重点实验室,湖南 怀化 418000; 3.脑与神经内分泌疾病湖南省高等学校重点实验室,湖南 怀化 418000)

0 引言

黄蜡果(StauntoniabrachyantheraHand.-Mazz)为木通科野木瓜属植物,常生长于海拔400～1 400 m的山地杂木林中[1],产于湖南、贵州、广西等地区[2]。果实的形态与三叶木通较为相似,果皮成熟时为黄色,平滑或稍具小疣凸,相比于三叶木通略微小[3]。人们通常将其当作预知子药用。湖南侗药称之为“猪腰子”[4],用于风湿关节痛、跌打损伤、小便淋痛、月经不调等症的治疗[5]。学者对黄蜡果叶[6]、根[7]、果实[8]、种子[9]、果皮[3]、藤茎[10]的化学成分均有研究,其主要成分为皂苷类及黄酮类化合物,但对黄蜡果的总皂苷研究较少。本研究对黄蜡果不同部位的总皂苷含量进行测定。采集湖南省怀化市中方县的黄蜡果叶、藤茎、根3个不同部位的药材,干燥粉碎,采用超声辅助萃取法,从中萃取出浸膏,利用D101大孔树脂对黄蜡果浸膏的总皂苷进行富集,并对其含量进行测定。从定量角度客观评价黄蜡果不同部位总皂苷含量的差异,所建立的黄蜡果总皂苷含量测定方法可为质量标准研究及开发提供科学依据。

1 仪器、材料与方法

1.1 仪器

AUW120D 型电子分析天平(日本岛津有限公司生产),MY-50分级连续投料粉碎机(广州市扬鹰医疗仪器有限公司生产),DZKW-S-8 电热恒温水浴锅(北京市光明医疗仪器有限公司生产),L53R 医用离心机(长沙高新技术产业开发区湘仪离心机有限公司生产), KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司生产),紫外分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司生产)。

1.2 材料

黄蜡果药材采集于怀化市中方县,由湖南医药学院汪冶教授鉴定并保存于湖南医药学院。齐墩果酸(中国食品药品检定研究院提供,110709-201808)。提取与分离纯化及紫外分光光度仪测定使用的试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 黄蜡果总皂苷的制备

取湖南省怀化市地区的黄蜡果叶(2.009 5 g)、藤茎(2.004 0 g)、根(2.004 2 g)粗品,干燥,打成粉末,过16目筛,按物料比25∶1加入70%乙醇,50 ℃超声萃取5次至萃取液无色。将萃取液减压干燥得到浸膏,将浸膏加入正丁醇超声萃取5次至无色得总浸膏。将总浸膏用50 mL的40%乙醇溶解,加入4 g氧化镁加热回流1 h过滤,减压浓缩,氮吹干燥,得叶总皂苷(0.222 6 g)、藤茎总皂苷(0.121 9 g)、根总皂苷(0.155 3 g)。

1.3.2 黄蜡果总皂苷含量的测定

1)对照品溶液的制备。取齐墩果酸标准品0.008 0 g定容于100 mL容量瓶中,得0.08 mg/mL齐墩果酸对照品溶液。

2)供试品溶液的制备。分别取根、藤茎、叶总皂苷的根(0.009 5 g)、藤茎(0.006 4 g)、叶(0.008 1 g),精密移取1.000 mL甲醇加热超声,使其完全溶解,得供试品溶液根(9.5 mg/mL)、藤茎(6.4 mg/mL)、叶(8.1 mg/mL)。

3)吸光度吸收曲线制备。精密吸取0.08 mg/mL齐墩果酸标准溶液0.625 mL加入具塞试管中,挥干溶剂,加入新制5%香草醛-冰乙酸0.2 mL,再加入0.8 mL高氯酸溶液,在70 ℃水浴中加热15 min,取出,流水冷却10 min,使之反应完全。加入4 mL乙酸乙酯,摇匀进行紫外460～800 nm波长扫描得吸收曲线,如图1所示。

图1 齐墩果酸标准溶液吸光度曲线Fig.1 Absorption curve of oleanolic acid standard solution

4)标准曲线的制备。分别精密吸取0.08 mg/mL的齐墩果酸标准溶液 0.062 6 mL、0.125 mL、0.25 mL、0.375 mL、0.5 mL、0.625 mL、0.75 mL加入具塞试管中,挥干溶剂,加入新制5 %香草醛-冰乙酸0.2 mL,再加入0.8 mL高氯酸溶液,在70 ℃水浴中加热15 min,取出,流水冷却10 min,使之反应完全。加入4 mL乙酸乙酯,摇匀,在561 nm下对其分别进行测定,将测定的吸光度进行线性回归计算,如表1所示,得线性回归方程,如图2所示。

表1 线性回归方程数据Tab.1 Linear regression equation data

图2 线性回归方程图Fig.2 Linear regression equation

2 结果与分析

2.1 总皂苷含量方法学考察

1)重复性试验。分别取叶、藤茎、根供试液样品6份,每份50 uL,按“1.3”中的方法操作得吸光度,计算RSD值,如表2、表3、表4所示。RSD分别为 1.85%、1.41%、1.11%,表明该方法重复性良好。

表2 叶重复性实验Tab.2 Leaf repeatability test

表3 藤茎重复性实验Tab.3 Vine stem repeatability test

表4 根重复性实验Tab.4 Root repeatability test

2)精密度试验。对照品按“1.3”中的方法重复操作6次,根据测定结果进行精密度计算,算得相对标准偏差(RSD),判断方法仪器精密度,如表5所示。RSD为0.79 %,证明该试验条件下精密度良好。

表5 精密度实验Tab.5 Precision test

3)稳定性试验。分别精密吸取叶、藤茎、根供试品溶液50 μL,按“1.3”中的方法操作,每隔3 min测定一次吸光度值变化,计算RSD值,如表6、表7、表8所示。叶、藤茎、根供试品的吸光度RSD分别为 0.67%、0.96%、0.60%,表明叶、藤茎、根的供试品溶液在15 min内稳定性良好。

表6 叶稳定性实验Tab.6 Leaf stability test

表7 藤茎稳定性实验Tab.7 Vine stem stability test

表8 根稳定性实验Tab.8 Root stability test

4)加样回收实验。分别吸取叶、藤茎、根50 μL的供试品溶液,加入0.3 mL齐墩果酸标准溶液,按“1.3”中的方法操作计算其含量,计算其回收率,如表9、表10、表11所示。平均值分别为 97.45%、98.75%、97.91%。

表9 叶加样回收实验Tab.9 Adding sample recovery test of leaf

表10 藤茎加样回收实验Tab.10 Adding sample recovery test of stem

表11 根加样回收实验Tab.11 Adding sample recovery test of root

2.2 紫外分光光度法测定总皂苷含量

分别取叶、藤茎、根供试品溶液50 μL,按“1.3”中的方法操作计算其含量,如表12、表13、表14所示,叶、藤茎、根的平均含量分别为0.701%、0.420 3%、0.493 7%。

表12 叶皂苷含量测定Tab.12 Saponin content of leaf determination test

表13 藤茎皂苷含量测定Tab.13 Saponin content of vine stem determination test

表14 根皂苷含量测定Tab.14 Saponin content of root determination test

3 讨论与结论

侗药黄蜡果总皂苷可以单独或与其他药物组合作为原料药用于抗肿瘤、抗炎、利尿及相关疾病治疗的药剂中[11]。通过大孔吸附树脂富集皂苷并对总皂苷进行纯化,采用紫外分光光度法,测定黄蜡果不同部位总皂苷含量并进行比较发现,叶总皂苷含量显著高于藤茎和根的含量。结果表明,利用分光光度法测定总皂苷的方法要求各项内容良好,可用于黄蜡果总皂苷含量测定并进行比较。该方法简单、快速,可用于其他药材皂苷的含量测定及比较,可为黄蜡果的定性分析与质量控制提供数据支撑及参考方法。