呼吸系统疾病与呼吸道微生态的研究进展

王静然，李鹏飞，刘 苗，陶艳琳，刘亚男，朱淑芬

（1.内蒙古医科大学附属医院， 内蒙古 呼和浩特 010050；2.内蒙古自治区人民医院脊柱外科， 内蒙古 呼和浩特010017；3.内蒙古医科大学附属医院体检中心，内蒙古 呼和浩特 010050）

随着呼吸道微生物检测方法的进步， 尤其是高 通 量 测 序 技 术 （high-throughput sequencing，NGS）的出现，实现了痰液微生物组学超越单一病原微生物的检测， 打破了人类对下呼吸道无菌状态的认识［1］。 16S rDNA 测序技术证明了下呼吸道存在一个独特的处于动态平衡中的微生物群落，并且该微生物群落以一个优化的比例维持微生态平衡，在预防呼吸系统疾病中发挥积极作用。呼吸道微生态处于动态平衡的状态是由Saeedi 等［2］提出的， 认为从呼吸道进入肺内的细菌随后将被迅速清除，使得肺部微生物群处于动态平衡状态，称为短暂停留不定居 （transient but not resident，TBNR）。 微生物群的多样性和组成由许多因素决定，包括宿主遗传因素、宿主免疫力及环境因素［3］。 近年来，不断有新的呼吸道菌群检测方法出现，人们对于呼吸道微生态有了进一步的认识， 并开始对呼吸道微生态与呼吸系统疾病之间的关系进行深入研究。 许多传统观念认为与微生物不相关的呼吸系统疾病现在考虑与不同于健康人肺部微生物“失调”有关，即微生物组成的不平衡，从而导致机体出现炎症反应和免疫紊乱［4］。 越来越多的研究通过16S rDNA 测序技术对健康人及呼吸系统疾病患者的痰标本进行呼吸道微生态的分析， 发现健康期间和呼吸系统疾病期间的微生物组成存在显著差异。 肺部微生物群不仅可能影响疾病的易感性或病因，还可能受到疾病活动或治疗反应的影响［5］。因此，本文将总结呼吸道菌群的检测方法以及近年来呼吸道微生态的研究进展，探讨呼吸道微生态与呼吸系统疾病发生发展的关系，以期对呼吸系统疾病的特异性诊断和治疗提供新的思路。

1 呼吸道菌群的检测方法

1.1 细菌培养及涂片

细菌培养及革兰染色涂片是检测呼吸道感染病原体的传统方式，是一种廉价、方便的实验室方法［6］，获取标本的方式包括经口自然咳痰、高渗盐水诱导咳痰、 口咽通气管或气管插管通路吸引以及支气管镜检获得支气管肺泡灌洗液等。 该项检查无法避免被口腔微生物污染的可能， 对呼吸道病原菌的诊断存在一定程度的影响。 在获得标本后必须完善痰液标本质量检测， 保证上皮细胞及白细胞计数符合标准。对于门诊的轻症患者，完善细菌培养及涂片的可行性不高，对于重症患者，尤其是对于咳脓痰或痰量明显增多的住院患者，细菌培养及涂片对疾病的诊治至关重要。 对于可疑合并有曲霉菌、 结核分枝杆菌及肺孢子菌等特殊病原体感染患者， 条件允许可行气管镜检查获取支气管肺泡灌洗液送检。 传统的培养技术为微生物研究奠定了基础， 但是其局限性在于无法进行整体微生物群落结构的分析， 并且培养法的敏感性容易受到抗菌药物的影响， 通过传统培养法检测到的微生物是有限的［7］。

1.2 高通量测序技术

高通量测序为一种价格低廉的大规模并行测序技术， 可允许同时独立测序数千位到数十亿DNA 片段［7］。 包括基于16S rDNA、18S rDNA、ITS等扩增子测序、 宏基因组测序以及全基因组测序等，其在微生态领域的应用，使呼吸道微生态的研究更加深入。 其中，16S rDNA 测序技术则是对特定环境中（疾病或健康状态）全部细菌基因组水平的高通量测序，分析其内部组成情况，明确该环境中微生物的种类及丰度［8］，同时，它也可以用作独立于培养的技术， 发现常规技术无法测得的致病菌。 研究发现，对整个16S rDNA 进行测序比对常见的靶向可变亚区测序具有更高的分类分辨率，其局限性在于高成本及采样深度有限，因此，可以通过对拥有高信息量的可变区进行测序实现这一目的［9］。 对于呼吸系统疾病的研究，可以对提取痰液总DNA 的16S rDNA 片段的V3、V4 可变区进行扩增，构建细菌基因组文库后测序，进行菌群结构组成、多样性及差异分析，不同于传统的培养技术仅仅针对部分致病菌的检查。 通过对整个呼吸道微生物进行研究， 分析群落组成变化与疾病发生发展之间的关系。 然而，16S rDNA 测序技术对整个呼吸道细菌组成的测定过程中无法识别已经死亡的细菌［8］，而呼吸道微生态是处于动态平衡中的， 该技术对最终得到的细菌群落的组成存在一定的影响。总之，不断发展的高通量测序正在彻底改变对微生物的研究。

1.3 荧光显微镜成像技术

呼吸道微生物的荧光显微镜成像， 是一种基于分子生物学的荧光成像技术， 将细菌通过多种不同的荧光探针进行可视化处理［10］，再利用荧光显微镜检测荧光标记的细菌信号， 从而实现细菌的检测。 该方法是一种简单易行、效益高、便携的微生物检测方法， 广泛适用于临床样本中的细菌鉴定， 是筛查和诊断各种不同病原菌导致的感染性疾病的基本方法，但是，一般的探针不能有选择性地识别不同的细菌种类。 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH） 是针对细菌识别的一种常用方法， 允许在属或种水平上识别目标微生物， 通过特定设计的核酸探针与细菌的DNA 或RNA 特定的区域发生特异性结合， 从而实现对目标细菌的特异性荧光染色， 之后对环境中未标记的细菌进行清洗， 即可得到目标细菌的荧光显像图［11-12］。 荧光显微镜成像技术，利用其可提供实时和高分辨率的微观及宏观信息， 具有快速和准确诊断的优点， 逐渐发展成为医疗机构内诊断的优势工具［13］。

1.4 细菌的光学检测方法

傅里叶变换红外光谱 （Fourier-transform infrared spectroscopy，FTIRS）是一种非侵入性的细菌检测工具， 可在不使用外源性染料或探针的情况下分析细胞，实现细菌病原体的快速、可靠、廉价和高效鉴定［14］。 它能够以红外频率对整个细菌细胞或其他部分进行生化扫描。 其原理是当样品暴露于红外光束时， 分子的振动行为会因传递能量量子而改变， 从而影响其振动和旋转模式［15］。FTIRS 是一种基于提取完整微生物细胞红外光谱信号相关生化特征的细菌分型方法［16］，用于微生物分型的三种主要红外光谱取样模式为透射、漫反射及衰减全反射。 目前已经发表了较多利用FTIRS 快速鉴别微生物的相关报告［17］，包括弯曲芽孢杆菌和嗜麦芽链球菌［18］、金黄色葡萄球 菌［19］等均有单独报道。

生物传感技术的出现， 为微生物的鉴别提供了快速灵敏的平台， 包括包含长周期光栅的光纤传感器［20］及光纤布拉格光栅［21］已被应用于 疾病诊断和环境检测领域。 目前已有研究报道表面增强拉 曼 普 光 谱 （surface -enhanced Raman spectroscopy，SERS）用于大肠杆菌的检测，但是该方法无法获得更大物种的所有拉曼普光谱带的完整信息，因此具有一定的局限性［22］。 Kaushik 等［23］利用基于生物功能化二硫化钼纳米片的光纤表面等离子体共振免疫传感器实现了大肠杆菌的快速检测， 该项研究使光纤传感器的灵敏度得到了显著的改善，但是也存在一定的局限性，包括其高成本及传感器后期的不稳定性。

2 呼吸道微生态的研究进展

肺组织是呼吸道微生态研究最理想的标本，但标本的获取难以实现。 痰液作为呼吸道微生态研究首选的标本，同样具有丰富的微生态信息，并且极易获得。有研究表明，因呼吸道的解剖学连续性，健康人群上下呼吸道细菌种类相似，差异仅仅在于细菌的生物量上， 其生物量从上到下呼吸道逐渐减少［24］，因此，可以选择低侵入性的方法，通过高渗盐水诱导咳痰获取标本进行16S rDNA 测序， 明确健康人和不同疾病状态下患者呼吸道微生态的构成， 研究呼吸道微生态与呼吸系统疾病之间的关系。

不同于传统的培养技术，Hilty 等［25］于2010年运用16S rDNA 测序技术，首次表明下呼吸道并不是无菌的，其存在一个特征性的微生物群，通过对支气管哮喘、 慢性阻塞性肺疾病 （chronic obstructive pulmonary disease，COPD） 患者以及健康对照者呼吸道微生物进行比较发现， 健康人的上下呼吸道微生物群相似， 而患者的呼吸道细菌群落可能会随着疾病而改变，因为16S rDNA 测序技术可以检测到环境中全部细菌基因组，该结果无法排除操作过程中污染的可能。 Erb-Downward 等［26］的一项针对健康者及COPD 患者支气管肺泡灌洗液的16S rDNA 测序表明，健康人的肺部同样存在丰富的微生物群落。由此可见，呼吸道微生物组作为人类基因的组成部分，可保障机体相关代谢的顺利进行， 共生菌在抵抗致病菌入侵方面也发挥积极作用，使呼吸道微环境处于相对稳定的状态［27］。Haldar 等［28］通 过16S rDNA 测 序 技 术 对 健 康 者 及COPD 患者呼吸道整体微生态进行研究， 表明健康者呼吸道常见的细菌门分别为厚壁菌门、 拟杆菌门和放线菌门，相比之下，在COPD 受试者中，变形菌则是最主要的菌门。 高通量测序技术的出现打破了人类对下呼吸道为无菌状态的认识［29］，激发了人类对于呼吸道微生态与呼吸系统疾病发生发展关系的探索。

3 呼吸道微生态与呼吸系统疾病

3.1 慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病是一种以持续气流受限为特征的常见呼吸系统疾病， 是一项可预防及治疗的重大公共卫生挑战，当其症状发生急性恶化时，称为慢阻肺急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）［30］。 导 致AECOPD 最常见的诱因为感染， 细菌感染占重要比例［31］。感染使呼吸道微生态平衡被破坏，加速了机体的炎症及免疫反应， 从而促使疾病进展，但是， 对于呼吸道微生态失衡与COPD 之间的因果关系仍然需要进一步研究明确。

在COPD 稳定期，呼吸道细菌负荷相对较低，丰度从上呼吸道至下呼吸道呈梯度下降［8］。 目前研究暂时无法明确疾病加重与呼吸道微生态失衡之间的因果关系，但是可以明确的是，随着COPD严重程度的增加， 其呼吸道菌群的多样性下降。COPD 患者呼吸道炎症反应增强以及疾病进展相关的肺部微生物群的变化已经得到证实［32］。 Su 等［33］研究发现， 与稳定期COPD 和健康对照组相比，AECOPD 组的呼吸道细菌多样性 （Shannon 和Simpson 指数）显著降低；在AECOPD 组的痰液样本中发现的最主要的细菌门是变形杆菌， 占微生物组的30%。与稳定期COPD 组相比，AECOPD 组中厚壁菌和拟杆菌的相对丰度降低， 而变形杆菌和放线菌的相对丰度增加。Wang 等［34］对我国汉族人群进行研究得出了相同的结论，AECOPD 组患者较COPD 稳定期患者呼吸道微生态多样性下降，但该项研究结果无法排除AECOPD 患者长期使用糖皮质激素或者抗生素的影响， 同时，AECOPD 的发生可能与呼吸道微生物多样性下降和变形杆菌比例增加相关，而流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌属及铜绿假单胞菌等常见的致病菌均属于变形菌门。

随着COPD 病情的进展， 呼吸道微生态发生变化，其多样性下降而丰度增加，共生菌与致病菌比例失衡， 可能是由于致病菌数量发生变化所导致，因此发现丰度增高的致病菌，对慢阻肺急性加重的治疗有着重要的临床意义， 通过对致病菌的针对性治疗从而达到气道微生态恢复稳态的目的，来延缓COPD 的进展，控制病情。

3.2 哮喘

哮喘是一种影响肺部气道的慢性疾病［35］，是肺部最常见的炎症性疾病， 对全球健康和经济造成了巨大的负担， 其特征是慢性气道炎症及气道结构重塑，研究表明，在气道结构变化的基础上，先天免疫机制与微生物群的相互作用是哮喘发生的主要原因［36］。 下呼吸道微生物失调在哮喘的发病机制中起重要作用，然而，目前对于呼吸道微生态失调与呼吸道炎症之间的因果关系没有明确阐述。

Marri 等［37］利用16S rDNA 测序技术对轻度活动性哮喘患者和非哮喘受试者诱导痰微生物群落特征进行比较， 发现所有的痰标本均含有5 个主要的细菌门：厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、梭杆菌门和拟杆菌门， 前3 个菌门占总序列的90%以上。变形菌门在哮喘患者中比例较高，结果具有统计学意义。相比之下，厚壁菌门和放线菌门在非哮喘受试者中更为常见， 但是该项结果不具有统计学意义，此外，与非哮喘样本相比，哮喘患者的样本具有更大的细菌多样性， 该研究表明了哮喘患者呼吸道细菌的负荷量及多样性均增加， 这与Hilty 等［25］的研究结果一致。 研究结果表明，呼吸道微生物在哮喘的发病中起重要作用［38］。 哮喘发病涉及远端支气管， 而这些部位的细菌丰度较上呼吸道明显降低， 关于呼吸道微生态失调与哮喘的发病机制还需进一步明确。

3.3 肺癌

肺癌是一种发病率高、死亡率高、生存率低的高负担疾病，吸烟是肺癌最重要的危险因素［39］，肺癌是癌症的主要死亡原因［40］。新出现的证据表明，肺部微生态失调可能通过影响代谢、 炎症或免疫反应从而在致癌过程中发挥重要作用［41］，但是，目前微生态失调如何导致肺癌发病机制的问题仍未解决。

Jin 等［42］利用宏基因组学对肺癌患者、非恶性肺部疾病患者及健康受试者的支气管肺泡灌洗液进行物种水平上的微生物群落特征研究发现，与健康受试者相比， 肺癌患者的下呼吸道微生物丰富度显著降低，但香农指数显著升高。与健康受试者相比， 非恶性肺部疾病患者的下呼吸道微生物丰富度较低。该实验表明，肺癌患者下呼吸道微生物种类较健康对照组显著减少， 但其物种多样性及均匀性较高。Liu 等［43］利用支气管镜防污染毛刷取样后， 对肺癌患者和健康对照者样本进行16S rDNA 测序发现，与健康对照者相比，肺癌患者的呼吸道微生物多样性显著降低。 该项实验结果与Jin 等［42］的结果并不一致。 对肺部微生物态与肺癌之间的关系进行研究， 可以更好地了解肺部微生物在肺癌发生中的潜在机制， 有利于肺癌的早期诊断，同时为肺癌的个性化治疗创造条件。

3.4 特发性肺纤维化

特发性肺纤维化 （idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种原因不明的慢性、进行性纤维化间质性肺病，是间质性肺疾病最常见的类型［44］。间质性肺疾病是一组异质性疾病， 遗传及环境因素之间的相互作用被认为是发病的主要因素， 然而导致其发生发展的机制尚不完全清楚。 目前对IPF的发病机制了解有限， 尽管已有抗纤维化的药物可用于临床，但是患者的预后仍然很差［45］。肺部微生物组可能影响间质性肺疾病的发生及发展，但是肺部微生态失调与疾病发生发展的因果关系尚未明确。

O′Dwyer 等［46］进行了一项前瞻性观察性研究，利用16S rDNA 测序技术对IPF 患者的支气管肺泡灌洗液进行研究， 发现进展性IPF 患者的细菌负荷明显高于非进展性IPF 患者，并且，细菌负荷的增加还与群落组成的显著差异和群落多样性丧失有关。 该结果表明可以利用呼吸道细菌负荷预测IPF 患者的疾病进展，但是同样无法证实细菌负荷增加与IPF 发生的因果关系。 Invernizzi 等［47］进行的一项前瞻性研究表明， 对受试者的支气管肺泡灌洗液进行16S rDNA 测序后发现，IPF 患者下呼吸道微生物群以厚壁菌门占主导地位， 与健康对照者相比，IPF 组厚壁菌门及放线菌门丰度增加且具有统计学意义， 并且IPF 组微生物群落均匀度降低。 该实验同样证明了IPF 微生物群落的特点是支气管肺泡灌洗液中的细菌负荷增加，并且与疾病进展相关， 其程度可以预测IPF 的进展速度和死亡风险。

目前的研究已经证明IPF 患者呼吸道细菌负荷可以预测疾病进展， 但尚未明确与疾病进展相关的特定微生物， 并且细菌负荷与疾病发生发展之间的因果关系尚未明确［48］。 目前的研究正着力寻找与微生态相关的IPF 潜在发病机制， 从而为IPF 的治疗提供科学依据。

3.5 囊性纤维化

囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）是一种常见的常染色体隐性遗传疾病，病变可累及肺部，肺部的囊性纤维化典型的临床表现为慢性阻塞性气道疾病伴有细菌定植， 主要为铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌［49］。慢性感染伴随气道炎症是CF 患者发病和死亡的主要原因。 目前对于肺部微生态与CF发病机制的关系仍存在一定争议。

在CF 患者中，可以观察到患者肺部微生物的迁移和消除出现失衡， 并且无论其处于稳定期或者加重期， 几乎所有的年轻患者均可在痰中检测到特定的呼吸道病原体，例如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等［50］。 Cuthbertson 等［51］对13 个CF 中心299 名患者的痰标本进行高通量测序发现，随着肺功能的降低， 微生物多样性丧失伴随着优势菌群的增加， 多样性与优势度之间存在显著的负相关，其中可见优势菌种铜绿假单胞菌，这与之前的试验一致［52］。 CF 的一个关键挑战在于如何使用呼吸道微生物态的信息指导呼吸道慢性感染的临床管理。 只有了解呼吸道微生物组之间的相互关系及其与宿主的关系才能进一步协助CF 的治疗，为进一步改善CF 患者的生活质量提供了希望。

3.6 支气管扩张

支气管扩张是一种异质性的慢性呼吸系统疾病，其特征是气道的病理性永久性扩张［53］，不同于遗传性疾病肺囊性纤维化导致，该处支气管扩张特指非囊性纤维化支气管扩张，目前没有批准用于支气管扩张的治疗方法［54］。在支气管扩张患者中，可以观察到肺部微生态失衡及微生物负荷增加，同时也检测到呼吸道病原微生物的定植， 发现最常见的细菌为铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌［55-56］。目前对于呼吸道微生态失衡与支气管扩张发病机制之间的因果关系尚不明确。

Lee 等［57］根据病情严重程度将63 名支气管扩张患者分为两组，利用16S rDNA 测序技术对其痰微生物组进行研究发现， 两组患者中常见的细菌门均是变形菌门和厚壁菌门， 两个研究组在细菌门水平上的相对丰度没有显著差异； 而在属水平上， 轻度支气管扩张组的嗜血杆菌和罗氏菌属明显多于中/重度患者组，而假单胞菌在中/重度患者组更为常见，并且都具有统计学意义。两组患者痰微生物群落多样性未见明显差异。 测序技术的出现， 可以更全面地分析支气管扩张患者肺部细菌的组成， 对于支气管扩张患者的慢性感染也有了更进一步的理解，通过对呼吸道微生态的认识，从而得到如何进行慢性呼吸道感染预防与管理的启示，延缓疾病的进展。

3.7 肺结核

肺结核是全世界主要的传染性死亡原因，全世界大约四分之一的人口潜伏感染结核分枝杆菌［58］。 结核分枝杆菌与肺内常驻微生物群相互作用，导致肺部微生态失调，这可能与肺结核的发生及发展相关。 目前对于呼吸道微生态与肺结核之间的关系知之甚少，相关的研究样本量比较小，还无法避免口腔微生物污染的可能。

Hu 等［59］利用16S rDNA 测序技术， 通过对163 名痰阴性疑似肺结核患者和12 名结核分枝杆菌阳性患者及其抗结核治疗后转阴的支气管肺泡灌洗液微生物组的特征分析发现，70 名患者感染结核分枝杆菌， 痰阴性患者样本中结核分枝杆菌患病率为42.9%，另外70 名患者根据肺结核指南诊断，剩余23 名患者为细菌感染导致，与痰阴性患者相比， 痰阳性患者的肺部微生物群落α 多样性显著降低， 两组患者的肺部微生物群落β 多样性存在显著差异。 痰阳性患者与抗结核治疗痰培养转阴的支气管肺泡灌洗液微生物群落特征相比， 经过治疗后的微生物群落具有更高的α 多样性。该研究结果提示，支气管肺泡灌洗液中结核分枝杆菌的存在可能会影响呼吸道微生态的构成，使其多样性降低。Hu 等［60］再次利用宏基因组测序技术， 对30 名痰阴性肺结核患者和30 名痰阳性肺结核患者的支气管肺泡灌洗液微生物组学特征进行研究发现， 两组样本中均检测到结核分枝杆菌，在痰阳性组中占优势，痰阳性患者组的α 多样性往往低于痰阴性组， 两组之间的β 多样性存在显著差异； 痰阳性组呼吸道微生物以结核分枝杆菌为主，而痰阴性组富含链球菌、普雷沃杆菌及奈瑟菌等，更加接近正常呼吸道微生物群，通过网络分析表明， 结核分枝杆菌对微生物群落结构有很大的影响， 结核分枝杆菌可能对特定的分类群存在竞争。该实验同样利用16S rDNA 测序对标本进行研究与前期利用16S 测序实验得出一致结论，同时该实验表明16S rDNA 测序方法低估了结核分枝杆菌， 并不是研究结核相关微生物组的最佳方式。

对肺部微生物群的进一步认识可能在今后肺结核的预防、诊断及治疗方面提供更好的策略。目前对于患者肺部微生物组的特征与肺结核的关系在很大程度上仍不明确。

4 益生菌在治疗呼吸系统疾病中的应用前景

益生菌已经成为未来治疗呼吸系统疾病的研究热点，益生菌可解释为给予足够的量时，会给宿主带来健康益处的活的非致病微生物［61］。 益生菌可能成为抗生素的替代疗法或联合疗法， 从而减少因过度使用或滥用抗生素治疗而产生的耐药性及微生态失衡。已有部分研究表明，口服益生菌将通过影响胃肠道菌群从而改变呼吸道菌群的组成［62］。胃肠道与呼吸道菌群如何相互影响，现代医学提出了肺肠轴的理论， 该理论是利用免疫系统和定植在肺和肠道的微生物群作为连接枢纽，形成连接肺部和肠道的双向轴［63］，这一理论对我国传统医学“肺与大肠相表里”做出了科学的解释。也有学者对益生菌鼻腔给药对呼吸道微生态的影响进行研究，发现鼻腔给药与口服相比，对于维持呼吸道微生态的平衡具有更高的疗效， 可以降低COPD 患者的免疫反应， 从而达到缓解病情的目的［64］。 但是，一项针对益生菌治疗COPD 疗效的Meta 分析表明， 虽然益生菌已被广泛应用并且具有一定的效果， 但是治疗COPD 的临床疗效和安全性尚不清楚［65］，因此，还需要对益生菌的作用机制进行深入研究后决定是否可以应用于临床治疗。

5 小结

新一代测序技术的出现， 使人类对呼吸道微生态的认识更加深入， 对于呼吸系统疾病的呼吸道微生态的研究也更加详细和全面。 鉴于上呼吸道微生物的影响， 痰标本所包含的微生态信息可能仅部分代表呼吸道微生态的情况。 呼吸道微生态受到多种因素的影响， 其与呼吸系统疾病发病机制的关系需要进一步明确。 呼吸道微生物组的研究仍然面临许多挑战，例如16S rDNA 测序技术中对可变亚区的选择， 痰标本的获取方法以及测序平台的选择，都会对最终获得的结果造成影响。益生菌作为未来治疗呼吸系统疾病的切入点，可以通过对机体炎症反应及免疫反应的调控和干预实现治疗的目的， 还可以通过直接参与平衡呼吸道微生态用于呼吸系统疾病的治疗中。