门冬氨酸鸟氨酸颗粒杂质谱分析及有关物质测定

刘海涛,侯金凤,寇晋萍,刘琦,齐麟（北京市药品检验研究院 国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室 中药成分分析与生物评价北京市重点实验室,北京 102206）

门冬氨酸鸟氨酸为L-鸟氨酸和L-门冬氨酸通过化学合成制备得到的稳定的二肽化合物。该品能直接参与肝细胞代谢，并能激活肝脏解毒功能中的两个关键酶，从而有效地改善肝功能，恢复机体能量平衡。主要用于治疗因急慢性肝病如肝硬化、脂肪肝、肝炎等所致的高血氨症[1]。门冬氨酸鸟氨酸最早于20世纪70年代在德国用于临床，并被美国FDA批准用于治疗肝性脑病。目前常用的剂型有粉针剂、颗粒剂、注射液，其中颗粒剂适用于患者早期及日常治疗，服用方便，安全有效[2]。

门冬氨酸鸟氨酸本身紫外吸收较弱，其含量通常采用柱前衍生HPLC法[3]测定，这种方法对于辅料较多的颗粒剂中有关物质的检查不太适合，一方面因为衍生试剂干扰较大，另一方面是衍生后产物不稳定，影响准确性。也有文献采用HPLC法测定门冬氨酸鸟氨酸原料、注射剂有关物质的报道[4-5]，但颗粒剂有关物质的报道基本没有。鉴于此，本文通过对门冬氨酸鸟氨酸基于合成路线的杂质谱分析，尝试建立了使用氨基柱HPLC方法测定门冬氨酸鸟氨酸颗粒有关物质，明确了需要重点关注的非工艺杂质，新方法能够保证主成分与杂质及辅料良好分离，杂质检出限均小于供试品浓度的0.002%，故而具有灵敏度高、专属性好等优点。具体报道如下。

1 仪器与试药

仪器与试药具体内容见表1。

2 方法与结果

2.1 杂质谱分析

2.1.1 工艺杂质分析 门冬氨酸鸟氨酸的合成路线见图1。从门冬氨酸鸟氨酸的合成路线可以看出，起始原料富马酸可能由于反应不充分而残留在终产品中，因此将其定为工艺杂质。马来酸为起始原料富马酸的同分异构体，苹果酸为L-天冬氨酸制备过程中可能产生的副产物，精氨酸为L-鸟氨酸制备过程中可能产生的副产物，MNA-III则作为最后一步中和反应的副产物，均定为工艺杂质。

图1 门冬氨酸鸟氨酸合成路线图

2.1.2 降解杂质分析 L-鸟氨酸分子结构中的5-位氨基在酸碱及高温等条件下进攻羧酸发生分子内的关环反应得到MNA-I。具体产生机理见图2。

图2 MNA-I的降解机理图

L-天冬氨酸分子结构中的氨基进攻另一分子结构中的4-位羧基发生分子间的缩合反应得到MNA-II。具体产生机理见图3。

图3 MNA-II的降解机理图

由原料药的合成工艺研究可知，马来酸、苹果酸、精氨酸、富马酸均为门冬氨酸鸟氨酸合成工艺中的工艺杂质，因此在原料药中进行研究和控制，不在制剂中进行控制。MNA-III虽然定为工艺杂质，但研究中发现高温条件下该杂质有增大趋势，因此将其在制剂中进行研究，但不作为特定杂质控制。由原料药和制剂的杂质分析及质量研究可知，MNA-I和MNA-II为门冬氨酸鸟氨酸的降解杂质，且在制剂的影响因素试验高温条件中，MNA-I的含量有所增长，故不仅在原料药中控制，还要在制剂中研究与控制。

2.2 有关物质检查方法

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agela Venusil XBP-NH2（250×4.6mm，5µm）；流动相：0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液[取磷酸二氢钾2.72g，加水500ml溶解后，加入浓氨溶液5ml，用水稀释至1000ml，混匀后用磷酸调节pH值至（5.60±0.05）]-乙腈（40∶60）；柱温：30℃；流速：1.3ml/min；UV检测器（检测波长205nm）；进样量：20μl。

2.2.2 溶液的制备及测定法 系统适用性溶液：取门冬氨酸鸟氨酸、MNA-Ⅰ、MNA-Ⅱ、MNA-Ⅲ对照品各适量，精密称定，分别加流动相定量稀释制成每1ml中约含门冬氨酸鸟氨酸4mg、MNA-Ⅰ12µg、MNA-Ⅱ6µg、MNA-Ⅲ 8µg的溶液，作为系统适用性溶液。

供试品溶液：取本品10袋，精密称定，计算平均装量。研细，取细粉适量（约相当于门冬氨酸鸟氨酸0.4g），精密称定，置100ml量瓶中，加0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液40ml使其溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。测定法：精密量取对照溶液20µl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的5%-10%；精密量取对照品混合溶液和供试品溶液各20µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至门冬氨酸保留时间的6倍。系统适用性及供试品溶液的典型色谱图见图4和图5。

图4 系统适用性溶液色谱图（1为MNA-Ⅲ峰，2为MNA-Ⅰ峰，3为门冬氨酸峰，4为鸟氨酸峰，5为MNA-Ⅱ峰）

图5 供试品溶液色谱图（1为辅料峰，2为未知杂质峰，3为MNA-Ⅰ峰，4为鸟氨酸峰，5为MNA-Ⅱ峰）

2.2.3 方法学考察 专属性试验：各峰间分离度大于1.5，符合要求。所用辅料在该测定条件下对杂质检查无干扰。门冬氨酸鸟氨酸原料、国内产品和原研产品，在所设计的酸、碱、氧化和高温降解条件下均不稳定，MNA-I含量均有所增长，碱和氧化条件下降解较为剧烈，MNA-I含量增长较多，并产生较大（大于1%）的未知杂质。在光照破坏条件下稳定，此色谱条件能将新增杂质与主峰完全分离；主峰峰纯度合格；物料守恒。方法专属性强。线性关系考察：取门冬氨酸鸟氨酸杂质MNA-I、MNA-II和MNAIII对照品各适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml含各组分约0.04mg的溶液，作为混合母液；精密量取混合母液1ml、8ml、2ml、3ml、4ml和8ml，分别置20ml、100ml、20ml、20ml、20ml、20ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别作为杂质线性1-6号溶液。取混合母液，直接作为杂质线性7号溶液。精密量取上述溶液各20µl，注入液相色谱仪，按初步拟定的有关物质方法测定，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。门冬氨酸鸟氨酸在4.055-81.106μg/ml浓度范围内线性关系良好，线性方程为y=2786x+565.2，r=0.9992；MNA-Ⅰ在2.099-41.982μg/ml浓度范围内线性关系良好，线性方程为y=39280x-5615，r=0.9999；MNA-Ⅱ在1.864-37.285μg/ml浓度范围内线性关系良好，线性方程为y=16708x-3300，r=0.9999；MNA-Ⅲ在1.989-39.788μg/ml浓度范围内线性关系良好，线性方程为y=9189x-512.3，r=0.9999；当有关物质检查时，门冬氨酸鸟氨酸对照溶液浓度为8µg/ml，MNA-I限度浓度为12μg/ml，MNA-II限度浓度为6μg/ml，MNA-Ⅲ限度浓度为8µg/ml，均满足测定要求。

检测限考察：取对照品溶液逐级稀释，测定各组分检测限，MNA-I检测限为0.414ng，相当于供试品溶液浓度的0.00021%；MNA-Ⅱ检测限为3.880ng，相当于供试品溶液浓度的0.00194%；MNA-Ⅲ检测限为0.793ng，相当于供试品溶液浓度的0.00040%；门冬氨酸检测限为20.118ng，相当于供试品溶液浓度的0.01006%；鸟氨酸检测限为80.471ng，相当于供试品溶液浓度的0.04024%；各杂质检测限信噪比均约为3，符合要求。

定量限考察：取对照品溶液逐级稀释，测定各组分定量限，MNA-I定量限为2.068ng，相当于供试品溶液浓度的0.00103%；MNA-Ⅱ定量限为7.761ng，相当于供试品溶液浓度的0.00388%；MNA-Ⅲ定量限为1.587ng，相当于供试品溶液浓度的0.00079%；门冬氨酸定量限为40.236ng，相当于供试品溶液浓度的0.02012%；鸟氨酸定量限为160.942ng，相当于供试品溶液浓度的0.08047%；各杂质定量限信噪比均约为10，符合要求。

溶液稳定性：对照品混合溶液进行溶液稳定性考察，结果在25.2h内，各成分峰面积的RSD均小于2.0%，说明对照品混合溶液在25.2h内稳定； 国产颗粒、国外市售Hepa-Merz®颗粒供试品溶液稳定性考察，结果在25.2h内均未检出新杂质，且各已有杂质含量均没有明显变化，说明供试品溶液在25.2h内稳定，能满足检测要求。

准确度考察：各杂质高、中、低不同浓度回收率均在85%-115%之间；MNA-I回收率平均值为98.3 %，RSD为3.23%，小于5.0%；MNA-II回收率平均值为111.2%，RSD为2.00%，小于5.0%；MNA-III回收率平均值为98.7%，RSD为4.97%，小于5.0%；各杂质高、中、低不同浓度回收率均在85%-115%之间，说明方法准确度较高。

系统适用性：取系统适用性溶液连续测定6次，各峰间的分离度均大于1.5，出峰顺序依次为MNA-III、MNA-I、门冬氨酸、鸟氨酸与MNA-II。说明系统适用性符合要求。

耐用性考察：取系统适用性溶液，调整色谱条件后进样测定，流速为1.1-1.5ml/min，柱温为25℃-35℃，流动相pH为5.4-5.8，流动相缓冲液与乙腈的比例为43∶57-37∶63范围内，各杂质间分离度符合要求，方法耐用；换用不同品牌色谱柱时，系统适用性溶液中MNA-Ⅰ与门冬氨酸峰无法分离，说明本方法对不同品牌色谱柱不耐用。色谱柱的品牌推荐Agela Venusil XBPNH2。为保证各组分峰保留时间的稳定，将pH值严格控制在（5.60±0.05）范围内。

3 讨论

3.1 杂质谱分析中可以看到，MNA-Ⅰ（L-鸟氨酸内酰胺）为L-鸟氨酸分子内的关环反应生成，MNA-II为L-天冬氨酸分子间的缩合反应生成，分子内的关环反应在通常的酸碱环境或高温条件下即可发生，分子间的缩合反应生成则需要较为苛刻的催化条件，因此杂质MNA-Ⅰ是门冬氨酸鸟氨酸原料和制剂中产生的主要已知杂质，应对其重点关注。

3.2 颗粒剂通常会使用较多的粘合剂和矫味剂，酸碱变化会导致杂质MNA-Ⅰ的生成，因此尽量避免使用可能会显著改变pH值的辅料，选择较为中性温和的粘合剂和矫味剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、无水枸橼酸、甘露醇、草莓香精等。

3.3 有关物质检查法的选择：目前可选择的方法有中国药典2020年版门冬氨酸鸟氨酸原料有关物质测定法以及门冬氨酸鸟氨酸原料药生产商厂家标准中有关物质检测方法，中国药典2020年版门冬氨酸鸟氨酸原料标准方法中，各峰间分离度最小为6.11，而原料药生产商厂家标准方法中，门冬氨酸与MNA-II分离度为1.05，不能有效分离。故参考中国药典2020年版门冬氨酸鸟氨酸原料标准拟定本品的有关物质检测方法。

3.4 色谱柱的选择 在实验过程中曾分别试验过waters NH2（250mm×4.6mm，5μm）、Thermo NH2（250mm×4.6mm，5μm）等各主要品牌的氨基色谱柱，但分离效能均没有Agela Venusil XBP-NH2（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱效果好，方法学考察耐用性试验中也可以看到，其他品牌色谱柱均不能使MNA-Ⅰ与门冬氨酸有效分离，因此本方法推荐使用Agela Venusil XBP-NH2色谱柱。

3.5 我国作为仿制药大国，仿制药质量参差不齐，对药品的安全性和有效性评价造成了严重影响。为全面提高仿制药的内在品质和制药企业的综合能力，同时确保人民用药安全，并降低医疗费用的支出，开展仿制药一致性评价工作十分必要。本研究建立的有关物质测定法同时考察了原料药、国内颗粒和原研颗粒在强制降解条件下的杂质变化情况，并测定了国内颗粒和原研颗粒的样品结果，为门冬氨酸鸟氨酸颗粒剂的一致性评价工作提供了重要的方法依据。