参芍消瘤方含药血清对人肝癌细胞生物学行为的影响

丁晓明 张贤梅 柯亭 昝俊杰 孙勤国

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）是全球第六大常见恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的第四大原因[1-2]，具有高发病率和高死亡率，患者常规治疗后存在预后不良和容易复发等临床问题[3-4]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路是调节细胞周期、增殖、凋亡和代谢的重要信号机制，针对该通路研发的抑制剂在治疗肝癌方面具有较大临床应用价值[5-7]。中药以低毒、多因素、多途径靶向等优点长期应用于临床，具有开发抗肝癌天然新药的巨大潜力[8]。靶向抑制PI3K/Akt 途径的天然药物被认为是很有前途的抗肝癌药物[9]。麝黄消瘤方是成肇仁教授治疗肝癌的临床经验方，可有效抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等生物学行为[10-11]。参芍消瘤方由麝黄消瘤方改进而来，是武汉市第三医院应用多年的治疗PLC 协定方。前期临床数据显示，参芍消瘤方可改善乏力、腹胀、胁痛等症状，改善PLC 患者因介入治疗、放疗等导致的不良反应，延长患者生存时间，提高生活质量[12]。但参芍消瘤方对人PLC 细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响尚不明确。本研究采用含参芍消瘤方的血清作用于人PLC 细胞，观察细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移和侵袭等生物学行为，与常用抗癌药物顺铂联合使用，探讨中西药物结合使用对人PLC 细胞生物学行为的影响，旨在为PLC药物研发提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物及细胞 SPF级SD大鼠5只，雄性，7～8周龄，体质量250～280 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物合格证：No.430727221100343247。于SPF 级环境中适应性喂养6 d 后进行实验。人肝癌细胞Bel-7402 购于赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。RPMI 1640（批号：SH30809.01B）购自美国Hyclone 公司，冻存；使用时37 ℃水浴解冻，加入10%FBS和1%青霉素、链霉素双抗。细胞在5%CO2、70%湿度、37 ℃细胞培养箱中培养，待细胞密度达80%时传代培养。

1.2 主要试剂 FBS（批号：c11095500bt）购自美国Gibco 公司。5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）细胞增殖检测试剂盒（批号：C10310-1）购自广州锐博生物技术有限公司。碘化丙啶（propidine iodide，PI）/Rnase 染色缓冲液、AnnexinVFITC/PI 凋亡检测试剂盒（批号：556547）购自美国BD公司。细胞计数试剂盒-8（cell-counting kit-8，CCK-8）（批号：CA1210）、结晶紫（批号：C8470）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒（批号：PC0020）购自北京索莱宝科技有限公司。兔抗PI3K 抗体（批号：PAB30084）、兔抗Akt抗体（批号：PAB30596）、兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartate protease 3，Caspase-3）抗体（批号：PAB30047）和兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号：PAB36269）均购自武汉贝茵莱生物科技有限公司。兔抗磷酸化PI3K（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）抗体（批号：ab278545）购自英国Abcam 公司。兔抗磷酸化Akt（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗体（批号：4060T）购自美国CST公司。

1.3 参芍消瘤方制备 该方包含丹参15.0 g，白芍15.0 g，黄芪15.0 g，白术10.0 g，茯苓10.0 g，白花蛇舌草15.0 g，党参12.0 g，莪术10.0 g，八月札10.0 g，郁金10.0 g，焦山楂20.0 g，麝香0.1 g，牛黄0.3 g，柴胡6.0 g，炮甲6.0 g，鳖甲15.0 g。所有药物均购自武汉市第三医院药房。麝香、牛黄研磨至细末，待用；余药加水1 000 ml 浸泡1 h，煎煮30 min，去渣再加入麝香、牛黄细末，再煎煮25 min，使汤药溶液浓缩至48.00 ml。密封，4 ℃保存备用。

1.4 含药血清制备 取28.57 ml 汤药液加入71.43 ml 0.9%氯化钠溶液配置成100.00 ml 药液。给大鼠灌胃1 次/d，10.00 ml/kg，连续5 d。最后1 次灌胃后1 h，采用3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血3.00 ml，3 000 r/min 离心10 min，吸取上层血清，置于56 ℃水浴中灭活30 min，-80 ℃冰箱保存备用。

1.5 药物浓度及干预时间筛选 采用CCK-8 法。取Bel-7402细胞接种于96孔板，调整密度至3×103/孔；培养至细胞贴壁，弃去上清液，加入含0、15%、20%、25%和30%体积分数含药血清的RPMI 1640 培养基，100 μl/孔，培养24、48 和72 h。加入10 μl CCK-8 溶液，继续培养4 h。酶标仪检测450 nm 处的吸光值，分别计算细胞抑制率，筛选含药血清干预的最佳体积分数和时间。

1.6 实验分组及处理 取正常培养细胞，分为对照组、含药血清组、顺铂组、含药血清+顺铂组。对照组使用常规RPMI 1640，含药血清组细胞使用含25%含药血清的RPMI 1640，顺铂组使用含5 mmol/L 顺铂的RPMI 1640[13]，含药血清+顺铂组使用25%含药血清和含5 mmol/L 顺铂的RPMI 1640。正常培养24～48 h，待用。

1.7 指标测定

1.7.1 细胞增殖数量的检测 采用EdU 染色法。收集各组细胞转移至6 孔板，加入含100 μl EdU（50 μmol/L）的培养基。孵育2 h 后，加入100 μl/孔含4%多聚甲醛的PBS 室温继续孵育30 min。根据EdU 细胞增殖检测试剂盒说明书方法，先后加入100 μl Apollo®染色反应液和100 μl Hoechst 33258 反应液，均避光摇床孵育30 min。使用荧光显微镜观察染色情况，EdU 染色后呈红色（细胞DNA 染色），Hoechst 33258 染色后呈蓝色（细胞核染色），将DNA 染色和核染色图叠加合并呈图，比较各组细胞数量的变化。

1.7.2 细胞周期检测 采用流式细胞术。收集各组细胞转移至6 孔板，正常培养，调整细胞密度为1×107/孔，1 350 r/min 离心5 min，收集细胞沉淀，PBS 重悬后，加入700 μl 无水乙醇，-20 ℃固定24 h。取出细胞，4 ℃，1 787 r/min 离心5 min，加入1.00 ml PBS 洗涤细胞2 次。加入0.5 ml PI/Rnase 染色缓冲液重悬细胞沉淀，室温孵育15 min。流式细胞仪上机检测细胞DNA 含量，确定待测细胞在细胞周期（G1期、S 期和G2期）所占比例，利用NovoExpress 软件进行结果分析。

1.7.3 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。收集各组细胞转移至6 孔板，正常培养，调整细胞密度为1×106/孔，1 350 r/min 离心5 min。加入200 μl PBS 重悬细胞，加入10 μl Annexin V-FITC 和10 μl PI，4 ℃避光孵育30 min。加入300 μl PBS，流式细胞仪上机检测处于第二象限（Q2-2）和第四象限（Q2-4）的细胞所占比例，利用NovoExpress 分析软件进行分析。

1.7.4 细胞迁移能力的检测 采用划痕法。使用6 孔板培养各组细胞，背后用马克笔竖着均匀画5 条直线，横穿过孔。调整细胞密度为1×106/孔，培养过夜。用无菌枪头垂直于背后直线划痕。PBS 清洗去划下的细胞，分别于0、48 h 拍照，比较不同分组细胞划痕宽度变化幅度，计算划痕闭合率，以此判断各组细胞迁移能力。

1.7.5 细胞侵袭能力的检测 采用Transwell 法。Transwell 小室用PBS 浸泡5 min 后取出，底部铺80 μl基底胶，静置30 min。收集各组细胞，用含1% FBS 的培养基调整细胞密度为1×106/ml。小室上室中加入0.50 ml 细胞悬液，下室中加入0.75 ml 含10% FBS 的培养基，培养24 h。加入1.00 ml 4%多聚甲醛固定20 min，加入1.00 ml/孔0.5%结晶紫溶液，染色30 min。擦去小室内没有侵袭的细胞，显微镜下观察并计数视野中的侵袭细胞数。

1.7.6 细胞p-PI3K、p-AKT 和Caspase-3 蛋白表达的检测 采用Western blot 法。各组取1×106个细胞进行裂解，提取细胞总蛋白。BCA 法进行蛋白定量后，SDS-PAGE 电泳分离。转膜、封闭。加入一抗（稀释比1∶1 000）室温孵育1 h，洗膜。加入二抗室温孵育1 h，洗膜。加入化学发光试剂，显影曝光。采用图像处理软件Image J 计算各蛋白条带灰度值，检测p-PI3K、p-Akt 和Caspase-3 蛋白表达水平。

1.8 统计学处理 采用SPSS 23.0 统计软件。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 含药血清作用浓度及时间筛选 随培养基中加入的含药血清体积增加，细胞抑制率逐渐升高，在25%时达到稳定。随培养时间延长，含药血清对细胞抑制率逐渐升高，在48 h 达到稳定，见图1。因此，选择含25%参芍消瘤方血清的培养基处理细胞，培养时间为48 h。

图1 培养基含药血清浓度及培养时间筛选（A：血清体积；B：培养时间）

2.2 含药血清对细胞增殖数量的影响 与对照组相比，含药血清组和顺铂组EdU 染色阳性细胞数显著减少（均P＜0.05），即细胞增殖能力下降；与顺铂组相比，含药血清+顺铂组EdU 染色阳性细胞数显著减少，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2（插页）。

图2 含药血清对细胞增殖数量的影响（A：4 组细胞增殖情况，×200；B：4 组细胞EdU 染色阳性数比较）

2.3 含药血清对细胞凋亡及细胞周期的影响 与对照组比较，含药血清组和顺铂组细胞凋亡率和S 期细胞占比显著升高（均P＜0.05）；与顺铂组比较，含药血清+顺铂组细胞凋亡率和S 期细胞占比显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3。

图3 含药血清对细胞凋亡及细胞周期的影响（A：4 组细胞凋亡情况；B：4 组细胞凋亡率比较；C：4 组细胞周期情况；D：4 组细胞S期占比比较）

2.4 含药血清对细胞迁移和侵袭能力的影响 与对照组比较，含药血清组和顺铂组细胞迁移速度减慢，侵袭细胞数量显著减少（均P＜0.05）；与顺铂组比较，含药血清+顺铂组细胞迁移减慢，侵袭数量显著减少，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图4。

图4 含药血清对细胞迁移和侵袭能力的影响（A：各组细胞迁移情况，×100；B：各组细胞划痕闭合率比较；C：各组细胞侵袭情况，×200；D：各组细胞侵袭数量比较）

2.5 含药血清对细胞Caspase-3 和PI3K/Akt 通路蛋白表达的影响 与对照组比较，含药血清组和顺铂组细胞p-PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平显著降低，Caspase-3蛋白表达水平显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与顺铂组比较，含药血清+顺铂组细胞p-PI3K和p-Akt 蛋白表达水平均显著降低，Caspase-3 蛋白表达水平显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5。

图5 含药血清对细胞p-PI3K、p-Akt 和Caspase-3 蛋白表达影响（A：蛋白电泳图；B：蛋白表达的比较）

3 讨论

传统医学中并无“肝癌”这一病名，随着时代发展，当代医生在传统中医理论指导下，逐渐对其病因形成一定认识[14]。气滞血瘀是肿瘤形成发展的主要病理机制，气滞可致血瘀，血瘀亦能加重气滞，故疏肝理气法是治疗本病的主要治法之一。《金匮要略》言“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”。故健脾益气法在肝癌及其转移的治疗中是一种极其重要的方法。参芍消瘤方中牛黄清热化痰，散结解毒消肿；麝香辛香走窜，活血通络止痛，并助牛黄化痰散结消肿；丹参活血化瘀，凉血消痈；莪术为血中气药，行气破血消积；柴胡疏肝理气行血，配以白芍养血柔肝，缓急止痛；黄芪、党参、白术、茯苓健脾益气以助中土，使脾气行则气血行，痰水消；炮甲善疏通经络、活瘀血、消痈肿、治恶疮；蛇舌草清肝热，解邪毒，抗癌消癥。全方共奏清热解毒，活血破瘀消癥，软坚散结，健脾理气之功。血清药理学是一种利用动物含药血清进行中药体外药理研究的药理学方法，具有体外实验和体内实验的优点，在中药药理研究中被广泛应用[15-16]。本研究制备参芍消瘤方含药血清作用于人肝癌细胞Bel-7402，结果显示含药血清可有效抑制Bel-7402 细胞增殖、迁移与侵袭，含药血清与顺铂联合使用对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用比顺铂单独使用更好，提示参芍消瘤方含药血清可有效抑制Bel-7402 细胞增殖与转移，建议与顺铂联合使用。

不受控制地增殖和细胞长时间存活是癌细胞的主要特征，肿瘤的形成是各种细胞周期调节因子异常表达导致染色体不稳定或凋亡途径改变的结果[17]。大量研究显示，激活PI3K/Akt 信号通路可促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭[18-19]。Caspase-3 是线粒体凋亡途径相关蛋白，Caspase-3 蛋白表达上调时，肝癌细胞凋亡增加，Akt/Caspase-3 通路在肝癌细胞增殖、凋亡和转移等生物学行为中发挥重要作用[20-22]。本研究结果显示，参芍消瘤方含药血清干预Bel-7402 细胞后，诱导细胞周期阻滞，细胞凋亡率显著升高，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 通路蛋白表达水平显著降低，Caspase-3 蛋白表达水平显著升高，含药血清与顺铂联合使用对细胞周期、凋亡及PI3K/Akt 通路蛋白的作用比顺铂单独使用更好，提示参芍消瘤方可能通过抑制PI3K/Akt 信号通路调控Bel-7402 细胞的周期、凋亡等生物学行为。

综上所述，参芍消瘤方含药血清可抑制Bel-7402细胞增殖、迁移、侵袭，诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，且与抗癌药物顺铂联合使用后对人肝癌细胞Bel-7402 生物学行为的影响优于顺铂单独作用，其作用机制可能与抑制PI3K/Akt 信号通路有关。后期研究可关注参芍消瘤方活性成分的分析，结合网络药理学与基础实验验证，为挖掘参芍消瘤治疗肝癌的潜在靶点提供支持。