传染性单核细胞增多症患儿外周血T淋巴细胞亚群变化及其临床意义

李慧，刘晶，杨金英

1.西北妇女儿童医院儿童血液肿瘤科，陕西 西安 710003；

2.宝鸡市妇幼保健院儿童感染科，陕西 宝鸡 721000；

3.西安市人民医院(西安市第四医院)新生儿科，陕西 西安 710000

传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis，IM)是一种由EB 病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染所致的急性传染性疾病，颈部淋巴结肿大、发热以及咽喉疼痛为IM 疾病典型临床表现。此外，患者还伴有外周血异型淋巴细胞水平上升以及肝脏脾脏肿大等相关表现[1-2]。IM好发于儿童群体，患儿感染后症状隐秘，未见明显临床表现，诊断存在难度，虽然IM为自限性疾病，大部分患儿预后良好，但是依然有少量患儿会出现嗜血细胞增多症等严重并发症，预后情况不佳[3]。目前尚未完全明确IM发病具体机制，但是已经了解到其发生与机体免疫功能紊乱关系密切[4-5]。因此探究IM 发生及病情进展与免疫功能之间关系不仅有利于分析IM 具体发病机制，还对患儿其后病情诊断以及治疗具有积极意义。本研究分析IM 患儿外周血T淋巴细胞亚群水平变化及其在患儿病情发生进展中作用，以深入了解IM 免疫功能异常状态，为后期患儿病情评估及治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018—2020 年宝鸡市妇幼保健院收治的105例IM患儿作为研究组。纳入标准：(1)IM 参照对应标准[6]确诊；(2)患者病情由临床表现、血清学病毒抗体以及外周血涂片实验等证实；(3)入组前尚未行任何对症治疗；(4)年龄1～13岁。排除标准：(1)存在重要器官如消化道、心脏、肝脏等功能异常者；(2)入组前应用免疫抑制剂或者糖皮质激素治疗者；(3)存在其他感染或者并发恶性肿瘤者；(4)并发先天性免疫异常疾病或者免疫功能障碍者。选取同期在医院体检的健康儿童100 例作为对照组。对照组儿童各项相关检查均正常，无其他疾病。研究组中男性56 例，女性49 例；年龄1～13 岁，平均(6.24±1.53)岁。对照组中男性51 例，女性49 例；年龄1～13 岁，平均(6.58±1.76)岁。两组儿童的性别和年龄比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理会批准，所有儿童监护人均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血T淋巴细胞亚群测定 外周血T淋巴细胞亚群应用流式细胞术进行测定，测定相应试剂以及抗体均采购自美国BD公司。研究组患儿在治疗前，对照组在体检当日收集空腹静脉血2 mL保存于肝素抗凝管中，加入等量磷酸缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)后进行外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)分离。将分离获得的50 μL PBMC加入10 μL CD3-PE-Cy5、10 μL CD4-PE、10 μL CD8-FITC，以涡旋方式混匀后在室温环境下进行15 min避光孵育，孵育结束后进行离心洗涤，将上清液弃去后加入300 μL PBS，12 h 内上机测定。其他分离获得PBMC中加入佛波酯、离子霉素以及莫能霉素，置于37℃及5%CO2环境中培养4～6 h，随后再次进行离心洗涤，收集100 μL 刺激培养细胞添加IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PE-Cy5 各20 μL 作为同型对照，涡旋混匀后在室温环境下进行15 min 避光孵育。另收集100 μL刺激培养细胞添加20 μL CD3-PE-Cy5与20 μL CD8-FITC 为待测样品管，涡旋混匀后避光孵育以进行细胞膜表面标记，离心、洗涤、重悬后加入100 μL固定剂进行15 min 室温避光孵育，离心、洗涤、弃去上清液后缓慢混匀，加入100 μm破膜剂，室温环境下避光孵育5 min后离心洗涤。待测样品管细胞均分为两管，分别向其中加入10 μL白介素-4-PE与干扰素-γ-PE，涡旋均匀后避光孵育处理15 min以使细胞内细胞因子染色，离心洗涤后将上清液弃去，随后在试管内加入PBS 300 μL 进行细胞重悬，上机测定CD8+、CD4+、CD3+水平，并计算CD4+/CD8+值。

1.2.2 患儿病程及病情严重程度评估 入院后依据病程将患儿分为急性期组与恢复期组，其中急性期为首次发病7 d 时间内，恢复期为初次发病至接受治疗后25～30 d[7]。依据IM所致系统损伤将患者分为轻症组与重症组，其中轻症为IM发生伴最多1个系统损伤，重症为IM发生伴最少两个系统损伤[8]。

1.3 统计学方法 应用SPSS20.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，计数资料表示为例，差异比较采用χ2检验，应用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析T 淋巴细胞亚群对IM 的诊断价值，应用Spearman 相关性分析外周血T 淋巴细胞亚群与病程、病情严重程度之间的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组儿童的外周血T淋巴细胞亚群比较 研究组儿童的CD8+、CD3+明显高于对照组，CD4+、CD4+/CD8+明显低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 两组儿童的外周血T淋巴细胞亚群比较(±s)Table 1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte subsets between the two groups of children(±s)

表1 两组儿童的外周血T淋巴细胞亚群比较(±s)Table 1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte subsets between the two groups of children(±s)

组别研究组对照组t值P值例数105 100 CD8+(%)40.33±7.26 21.59±6.28 19.724 0.001 CD4+(%)20.53±5.19 35.94±6.57 18.682 0.001 CD3+(%)78.29±7.54 62.94±8.14 14.015 0.001 CD4+/CD8+0.63±0.19 1.34±0.43 15.414 0.001

2.2 T 淋巴细胞亚群对IM的诊断价值 经ROC分析结果显示，CD8+、CD4+、CD3+、CD4+/CD8+用于IM诊断的曲线下面积(AUC)分别为0.850、0.848、0.810、0.771，见表2和图1。

图1 T淋巴细胞亚群对IM诊断价值的ROC曲线分析Figure 1 ROC curve analysis of the diagnostic value of T lymphocyte subsets in IM

表2 T淋巴细胞亚群对IM的诊断价值Table 2 Diagnostic value of T lymphocyte subsets in IM

2.3 不同病程患儿的T 淋巴细胞亚群水平比较 依据病程进行分组，105 例患儿中急性期与恢复期分别68 例与37 例，急性期组儿童的CD8+、CD3+明显高于恢复期组，CD4+、CD4+/CD8+明显低于恢复期组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 不同病程患儿的T淋巴细胞亚群水平比较±s)Table 3 Comparison of T lymphocyte subsets between children with different courses of disease(±s)

表3 不同病程患儿的T淋巴细胞亚群水平比较±s)Table 3 Comparison of T lymphocyte subsets between children with different courses of disease(±s)

组别急性期组恢复期组t值P值例数68 37 CD8+(%)44.23±5.79 33.16±2.89 10.896 0.001 CD4+(%)18.19±3.22 24.83±5.40 7.898 0.001 CD3+(%)80.55±7.22 74.14±6.31 4.539 0.001 CD4+/CD8+0.59±0.17 0.70±0.20 3.038 0.003

2.4 不同病情严重程度患儿的T 淋巴细胞亚群水平比较 依据患儿病情严重程度进行分组，105 例患儿中轻症与重症患儿分别43 例与62 例，重症组儿童的CD8+、CD3+明显高于轻症组，CD4+、CD4+/CD8+明显低于轻症组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 不同病情严重程度患儿的T淋巴细胞亚群水平比较(±s)Table 4 Comparison of T lymphocyte subsets between children with different disease severity(±s)

表4 不同病情严重程度患儿的T淋巴细胞亚群水平比较(±s)Table 4 Comparison of T lymphocyte subsets between children with different disease severity(±s)

组别轻症组重症组t值P值例数43 62 CD8+(%)33.94±5.29 44.76±4.67 11.050 0.001 CD4+(%)23.96±5.14 18.15±3.70 6.736 0.001 CD3+(%)74.22±3.64 81.11±8.25 5.132 0.001 CD4+/CD8+0.73±0.18 0.56±0.17 4.979 0.001

2.5 外周血T淋巴细胞亚群与病程、病情严重程度的相关性 经Spearman相关性分析结果显示，外周血CD8+、CD3+水平与病程呈负相关(P＜0.05)，CD4+、CD4+/CD8+水平与病程呈正相关(P＜0.05)；外周血CD8+、CD3+水平与病情严重程度呈正相关(P＜0.05)，CD4+、CD4+/CD8+水平与病情严重程度呈负相关(P＜0.05)，见表5。

表5 外周血T淋巴细胞亚群与病程、病情严重程度的相关性Table 5 Correlation analysis between peripheral blood T lymphocyte subsets and course of disease and disease severity

3 讨论

IM为EBV侵入导致全身免疫功能损伤传染类疾病，B淋巴细胞表面存在EBV受体，EBV在人体与对应受体结合后可以促进含有核抗原B淋巴细胞增殖，诱使淋巴细胞出现异型，促进T淋巴细胞免疫应答以及增殖过程，最终导致IM发生以及患者病情进展[9-10]。研究显示IM 发生为继发恶性组织细胞增生症以及淋巴细胞白血病重要危险因素，其也是儿童恶性肿瘤发生重要原因之一，IM患儿免疫功能缺乏以及不足是患者预后不佳重要原因之一，因此及时评估IM 患儿免疫功能是避免病情进一步恶化，改善患儿预后关键[11]。

本研究结果显示，IM组儿童CD8+、CD3+明显高于对照组，CD4+、CD4+/CD8+显著低于对照组，表明IM患儿T细胞会因为HBV感染而被激活，导致T细胞不断增殖，使细胞毒T 细胞以及抑制T 细胞水平增加。陈若红等[12]研究认为相对于健康儿童，IM 组儿童CD8+水平较高，CD4+、CD4+/CD8+水平较低，该研究认为IM患儿体内细胞免疫功能损伤，同时免疫调节功能异常，机体对于病毒防御能力减弱，最终导致IM 发生。另一项研究中也显示IM 患儿CD3+、CD8+水平较健康者高，CD4+、CD4+/CD8+水平较健康者低，细胞免疫在EBV 感染中发挥重要作用，IM 患儿细胞免疫功能异常，测定其水平可以为IM诊断提供重要依据[13]。本研究为进一步明确T 淋巴细胞亚群在IM 患者病情评估中作用，将CD8+、CD4+、CD3+、CD4+/CD8+水平应用于IM患儿病情诊断中，ROC曲线显示各指标用于IM 诊断AUC 分别为0.850、0.848、0.810、0.771，显示T 淋巴细胞亚群水平测定在IM 病情评估中有一定价值，间接证实其在IM发生中发挥重要作用。

本研究中急性期组儿童CD8+、CD3+显著高于恢复期组，CD4+、CD4+/CD8+显著低于恢复期组，表明T淋巴细胞亚群水平与患者病程关系密切，分析认为急性期CD8+、CD3+水平上调，CD4+水平下调，显示免疫促进作用增强，免疫抑制作用减轻，这一变化有助于促进T细胞对EBV裂解循环蛋白作用，进而使EBV特异性CD8+细胞大量增殖，帮助杀灭已感染EBV B 细胞，进而促进机体对于病毒清除作用[14-15]。另有研究显示，相对于健康者，IM 急性期CD4+、CD19+、CD16+56+降低，恢复期CD4+、CD19+、CD16+56+上升，分析认为患儿CD4+可以促进功能性细胞因子形成，抑制EBV 感染B 细胞转化过程，而CD8+细胞则可以有效识别EBV 裂解期抗原，促进机体对于EBV 阳性B 细胞杀伤作用[16]。本研究相关性分析结果显示外周血CD8+、CD3+水平与病情严重程度正相关(r=0.494、0.614)，CD4+、CD4+/CD8+水平与与病情严重程度负相关(r=-0.319、-0.747)，显示不同病情严重程度患儿T淋巴细胞亚群水平不同。另有研究显示痰热炽盛型IM患儿在应用更昔洛韦联合蒲地蓝口服液进行治疗，治疗后患者病情减轻，CD8+、CD3+水平下降，CD4+、CD4+/CD8+水平上升，也显示T 淋巴细胞亚群水平与患者病情关系密切[17]。相对于无肝损伤IM 患儿，IM肝损伤患儿体内CD8+毒性作用以及细胞杀伤能力未见增强，但是CD8+数目显著增加，也显示CD8+水平变化可能与IM患儿病情进展[18]。

综上所述，IM 患儿体内T 淋巴细胞亚群水平异常，提示患儿免疫功能异常，且这种异常与IM 发生、病情严重程度关系密切，可为患儿临床诊断、治疗提供相关理论依据。