雷公藤甲素对小鼠口腔鳞癌淋巴结转移的抑制及对HOXC10 的影响

杜雯雯，廖镇，刘洪建

雷公藤具有消炎、抗肿瘤的作用，并与免疫调节有关[1]。体内外实验已经证实其抑制卵巢癌、鼻咽癌等恶性肿瘤效果明显[2]。口腔鳞状细胞癌在全身恶性肿瘤中排行第六位，且随着生活压力的加重与生存环境的恶化，其发病率与致死率逐年上升[3]。口腔鳞状细胞癌常向淋巴结区域转移，如舌癌可发生早期淋巴结转移，且转移率较高[4]。目前口腔鳞状细胞癌诊断与治疗技术有很大提高，但其机制还未明确，影响口腔鳞癌治疗效果[5]。本研究探讨雷公藤甲素对口腔鳞状细胞癌淋巴结转移的影响及可能作用机制，以期为口腔鳞癌治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级Balb/c 小鼠120 只，雄性，6 周龄，体质量22～24 g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，生产许可SCXK（浙）2019-00015。温度18～22℃，湿度50%～60%，适应性饲养3 d。

1.1.2 主要试剂与仪器 雷公藤甲素（浙江得恩德制药股份有限公司），兔抗小鼠沉默同源框C10（Homeobox C10，HOXC10）、钙黏蛋白（epidermal cadherin，E-cadherin）、神经型钙黏附蛋白（neural cadherin，N-cadherin）、波形蛋白（Vinmentin）、瘤细胞角蛋白（pancytokeratin，pan-CK）一抗和山羊抗兔二抗（Abcam 公司，英国），反转录试剂盒、BCA 试剂盒（Takara 公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 建模与分组 从120 只小鼠中随机选取105只参照李晶等[6]报道的方法建立口腔鳞癌淋巴结转移模型，4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）用无菌水配成2.0 g/L 的溶液，用自来水稀释成20 mg/L 的溶液，喂养4-NQO 稀释液32 周，每只小鼠平均每天饮水量20 mL，剩余15 只为对照组，每天喂养等量自来水。8～10 周后，大部分小鼠舌背根部人字沟附近出现白色斑块，并逐渐向舌尖部蔓延，并在口底、牙龈、上腭出现；11～18 周后，白色斑块增大，粗糙，呈颗粒状或出现裂痕；19～27周后，个别小鼠人字沟附近呈现溃疡状生长，在其他小鼠牙龈、腭部、唇部陆续发现溃疡，且部分小鼠颌下淋巴结肿大；28～32 周，大部分小鼠有原发灶肿瘤以及同侧或双侧下颌淋巴结转移。将建模成功的74 只小鼠随机分为模型组24 只，低剂量组和高剂量组各25 只。

1.2.2 干预方法 建模成功后24h，参照文献[7]用量，低剂量组和高剂量组分别按照5、10 mg/kg灌胃雷公藤甲素，模型组和对照组灌胃等量生理盐水。每天给药1 次，共2 周。

1.2.3 组织取材 干预结束，所有小鼠处死。取部分舌部组织，PBS 冲洗后放4%多聚甲醛中固定保存，其余-80 ℃冷冻保存；取颌下淋巴结，PBS冲洗后放入冻存管冰盒保存。

1.2.4 HE 染色观察舌部病理变化 取4% 多聚甲醛固定的舌部组织，脱水，浸蜡，包埋，切片（5 µm），HE 常规染色，光镜下观察。

1.2.5 免疫组化染色 取冻存管冰盒内颌下淋巴结，制作冰冻切片（5 µm），丙酮溶液固定15 min，PBS 清洗2 min×3 次；3% H2O2 静置8 min，PBS 清洗2 min×3 次；每张玻片切片组织处滴加50 µL 一抗E-cadherin（1:100）或pan-CK（1:100），置于湿盒中，室温孵育2 h，PBS 清洗2 min×3 次；滴加通用二抗100 µL，37 ℃孵育30 min，PBS 清洗2 min×3 次；DAB 显色2 min，显微镜下观察染色情况。

N-cadherin 蛋白表达于细胞质，呈棕黄色颗粒，若细胞胞质中出现明显的棕黄色染色则为阳性表达。pan-CK 蛋白阳性染色定位在细胞质、细胞膜内，为棕黄色染色颗粒。镜下出现pan-CK 阳性染色细胞时，即为播散肿瘤细胞（DTC，disseminate tumor cells）阳性，淋巴细胞单核细胞不着色。

1.2.6 RT-qPCR 检测mRNA 表达取80 mg 保存于-80 ℃的小鼠舌部组织，冰上研磨，提取总RNA，逆转录试剂盒反转录为cDNA。进行RT-qPCR，检测CD44 拼接变异体v6（cell differentiation 44 splice variant v6，CD44v6）和肿瘤转移抑制基因nm23（non-metastatic 23rd，nm23）mRNA 表达水平。PCR 反应条件为预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 15 s；退火57 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s，共40 个循环，4℃终止反应。以GAPDH 为内参基因，采用2-△△Ct 法对数据进行相对定量分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western Blot 检测蛋白相对表达水平 取100 mg 保存于-80℃的小鼠舌部组织，加入蛋白提取裂解液，冰上裂解，离心取上清用BCA 蛋白定量试剂盒进行定量，95 ℃水浴使蛋白变性，进行SDS-PAGE 凝胶电泳，电转至PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，洗膜后分别加入1:1 000 稀释的HOXC10 多克隆抗体，E-cadherin、N-cadherin和Vinmentin 一抗，4℃孵育过夜，洗膜后加入1:4 000 山羊抗兔二抗，室温孵育1 h，洗膜后加入ECL 发光液显影，采用ImageJ 软件分析图像，以β-actin 为内参，各蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值表示HOXC10、E-cadherin、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS24.0 统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用LSD-t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE 染色观察舌部病理变化 对照组舌部表面光滑，颜色正常；模型组口腔癌细胞团块状排列，中心部分可见角化珠；低剂量组舌部中重度异常增生，上皮钉突明显增长；高剂量组黏膜上皮基底细胞极性消失，细胞的核浆比例增加，轻度异常增生。见图1。

图1 舌部病理变化（HE×200）

2.2 各组小鼠淋巴结N-cadherin 表达比较 对照组在口腔黏膜上皮基底层中可见极少量N-cadherin 阳性染色，染色浅；模型组在淋巴结转移癌组织中可见大量N-cadherin 阳性染色，染色深；低剂量组在口腔鳞癌组织上皮基底层、癌巢中心的细胞上可见N-cadherin 阳性染色，染色深；高剂量组在口腔异常增生组织有N-cadherin 阳性染色，染色浅。对照组、模型组、低剂量组和高剂量组N-cadherin 阳性率分别为（14.76±4.75）%、（78.95±6.42）%、（53.48±6.13）%、（32.53±5.52）%。与对照组比较，模型组、低剂量组和高剂量组N-cadherin阳性率升高（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组和高剂量组N-cadherin阳性率降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组N-cadherin 阳性率降低（P＜0.05）。见图2。

图2 N-cadherin 在各组小鼠中的表达（×200）

2.3 各组小鼠淋巴结DTC 表达比较 对照组颌下淋巴结中有个别pan-CK 阳性细胞，染色浅；模型组鳞癌转移颌下淋巴结中有成片分布的pan-CK 阳性细胞，染色深；低剂量组鳞癌未转移颌下淋巴结中散在分布pan-CK 阳性细胞，染色深；高剂量组在口腔异常增生颌下淋巴结有少量散在分布pan-CK 阳性细胞，染色浅。对照组、模型组、低剂量组和高剂量组pan-CK 阳性率分别为（9.76±3.23）%、（82.25±4.88）%、（48.29±4.16）%、（26.23±3.67）%。与对照组比较，模型组、低剂量组和高剂量组pan-CK 阳性率升高（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组和高剂量组pan-CK 阳性率降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组pan-CK 阳性率降低（P＜0.05）。见图3。

图3 DTC 在各组小鼠中的表达（×200）

2.4 各组小鼠原发灶组织CD44v6、nm23 mRNA表达水平比较 CD44v6、nm23 mRNA 表达水平组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，模型组、低剂量组和高剂量组CD44v6 mRNA 表达水平升高，nm23 mRNA 表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组和高剂量组CD44v6 mRNA 表达水平降低，nm23 mRNA 表达水平升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组CD44v6 mRNA 表达水平降低，nm23 mRNA表达水平升高（P＜0.05）。见表2。

表2 CD44、nm23 相对表达水平（，n=5）

表2 CD44、nm23 相对表达水平（，n=5）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与低剂量组比较，cP ＜0.05。Note: Compared with the control group,aP ＜0.05;compared with the model group,bP ＜0.05;compared with the low-dose group,cP ＜0.05.

2.5 各组小鼠原发灶组织HOXC10、N-cadherin、Vinmentin 和E-cadherin 蛋白相对表达水平比较HOXC10、N-cadherin、Vinmentin 和E-cadherin 蛋白相对表达水平组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，模型组、低剂量组和高剂量组HOXC10、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白相对表达水平升高，E-cadherin 蛋白相对表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组和高剂量组HOXC10、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白相对表达水平降低，E-cadherin 蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组HOXC10、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白相对表达水平降低，E-cadherin 蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）。见表3，图4。

图4 HOXC10、N-cadherin、Vinmentin 和E-cadherin蛋白相对表达水平

表3 HOXC10、N-cadherin、Vinmentin 和E-cadherin蛋白相对表达水平（x±s，n=5）

3 讨论

雷公藤甲素是雷公藤的主要活性成分之一，能明显抑制肿瘤细胞的增殖，低浓度就有明显抑瘤效果，与其他化疗药物合用能显著增强化疗效果[8]。研究发现，结合雷公藤甲素的治疗窗、安全范围、治疗指数等，提示雷公藤内酯醇在头颈部恶性肿瘤的化疗中具有一定的临床应用价值[9]。口腔鳞状细胞癌主要经淋巴道向其他部位转移，淋巴转移程度是影响患者预后非常重要的因素[10]。因此，探讨雷公藤甲素对小鼠口腔鳞癌淋巴结转移的抑制作用，在临床上具有一定指导意义。

雷公藤甲素是一个具有多种生物活性的天然产物，研究表明它具有抗氧化，抗类风湿，抗老年性痴呆症、抗癌等功效，是雷公藤片、雷公藤多甙片等制剂的主要有效成分[11]。研究发现，肿瘤组织黏着斑激酶无论mRNA 水平还是蛋白水平都受到雷公藤甲素的抑制，且雷公藤甲素抑制黏着斑激酶基因的表达对肿瘤细胞的迁移以及肿瘤在动物体内的转移具有抑制作用，提示雷公藤甲素既能抑制肿瘤细胞体外迁移，又能抑制肿瘤细胞体内转移[12]。临床研究证明，雷公藤甲素联合化疗一线治疗复发性鼻咽癌具有良好临床效果[13]。体外实验研究显示，雷公藤甲素能抑制人肺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力[14]。N-cadherin 属于钙黏蛋白家族，在肿瘤侵袭和转移过程中，上皮组织的钙黏蛋白向神经组织的钙黏蛋白转化，导致上皮细胞失去极性，细胞间黏连丧失，并获得间充质特性，促进上皮组织发生肿瘤并获得侵袭和转移能力。肿瘤细胞间粘附能力下降，是大多数恶性肿瘤细胞入侵周围组织和远处转移的第一步，DTC 是肿瘤转移和发展过程中的重要环节。本研究中雷公藤甲素高剂量组HE 染色后舌部病理变化显著改善，N-cadherin 和DTC 阳性细胞率降低，提示雷公藤甲素可抑制小鼠口腔鳞癌淋巴结转移。CD44 是细胞表面分布较为广泛的跨膜糖蛋白，主要参与异质性黏附，异质性黏附能够促进肿瘤细胞侵袭转移[15]。研究发现CD44 在小细胞肺癌细胞系及组织中表达，且其表达存在异质性，提示CD44 可能与癌浸润转移有关[16]。nm23 编码产物具有抑制肿瘤转移的功能，其基因表达与淋巴结转移呈负相关[17]。研究中发现nm23 能够抑制癌细胞株的运动能力和转移能力[18]。本研究中雷公藤甲素治疗后CD44v6 表达下调，nm23 表达上调，提示雷公藤甲素能够抑制口腔鳞癌的转移。Vimentin 和E-cadherin 均与肿瘤转移密切相关，Vimentin 调节细胞骨架蛋白、细胞粘附分子等蛋白间的相互作用，参与肿瘤细胞和肿瘤相关内皮细胞、巨噬细胞的粘附、迁移和信号转导，与肿瘤发生、转移密切相关[19]。E-cadherin 下调会导致细胞粘附功能障碍，且具有高度浸袭性，E-cadherin的表达与癌细胞的浸润与转移有关[20]。HOXC10基因异常表达，会导致个体发育和组织器官形成异常，参与胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤转移和侵袭过程[21-22]。HOXC10 表达水平升高可促进头颈部鳞状细胞癌细胞迁移和增殖[23]，也可通过调节上皮间质转化促进口腔鳞状细胞癌迁移和侵袭，靶向抑制其表达可能是临床预防鳞状细胞癌的潜在治疗方式[24]。本研究中雷公藤甲素高剂量组HOXC10、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白相对表达水平降低，E-cadherin 蛋白相对表达水平升高，提示雷公藤甲素可能通过降低HOXC10 的表达，进而抑制口腔鳞癌淋巴结转移。

综上所述，雷公藤甲素对小鼠口腔鳞癌淋巴结转移具有抑制作用，且可能通过抑制HOXC10表达发挥作用。