不同频率电刺激对2型糖尿病大鼠血糖水平及骨骼肌卫星细胞激活的影响

郑密 黄新一 李莹 及莹 刘妍妍 陈德明

摘 要：目的：本文旨在探究不同电刺激参数对大鼠机体血糖调控和骨骼肌卫星细胞的激活效果。方法：通过比较不同参数条件的肌肉电刺激对2型糖尿病大鼠的空腹血糖浓度和口服葡萄糖耐量的改善效果，验证肌肉电刺激对2型糖尿病大鼠机体血糖调控的影响以及确定对大鼠血糖调控最有效的电刺激条件。以及对大鼠骨骼肌卫星细胞标志性蛋白Pax7、MyoD和MyoG进行免疫荧光染色，比较不同参数条件的肌肉电刺激对大鼠肌肉卫星细胞激活效果。结果：（1）20 Hz、40 Hz和100 Hz都对2型糖尿病大鼠的空腹血糖浓度和口服葡萄糖耐量具有改善作用，其中40 Hz电刺激改善效果最为明显。（2）100 Hz电刺激对大鼠肌卫星细胞的激活效果最为明显。结论：三种电刺激诱导肌肉自主收缩来控制机体血糖，其中，40 Hz电刺激改善效果最明显；三种刺激均可有效诱导肌卫星细胞的激活，100 Hz电刺激的激活效果最显著。

关键词： 2型糖尿病；电刺激；空腹血糖浓度；耐量；肌卫星细胞；频率；大鼠

中图分类号：G804

文献标识码：A

文章编号：1008－2808（2023）02－0011－07

Abstract：  Objective： To explore the effects of different electrical stimulation parameters on the regulation of blood glucose and the activation of skeletal muscle satellite cells in rats. Methods： By comparing the effects of muscle electrical stimulation with different parameters on fasting blood glucose concentration and oral glucose tolerance in type 2 diabetic rats， the effects of muscle electrical stimulation on blood glucose regulation in type 2 diabetic rats were verified and the most effective electrical stimulation conditions for blood glucose regulation in rats were determined. And comparing the activation effects of muscle electrical stimulation  with different parameters on rat muscle satellite cells by immunofluorescence staining of marker proteins Pax7， MyoD and MyoG of rat skeletal muscle satellite cells. Results： （1） 20 Hz，   40 Hz  and 100 Hz electrical stimulation could improve the fasting blood glucose concentration and oral glucose tolerance in type 2 diabetic rats， and the effect of 40 Hz electrical stimulation was the most obvious. （2） The effect of 100 Hz electrical stimulation

on the activation of rat muscle satellite cells was the most obvious. Conclusion： Three kinds of electrical stimulation induce muscle contraction to control blood glucose， among which  40 Hz  electrical stimulation has the most apparent improvement effect; all three types of electrical stimulation can effectively induce the activation of muscle satellite cells， and the activation effect of 100 Hz electrical stimulation is the most significant.

Key words： Type 2 diabetes； Electrical stimulation； Fasting blood glucose concentration； Glucose tolerance； Muscle satellite cells； Frequency； Rat

隨着时代的发展，人们物质生活水平得到了显著提升，生活节奏不断加速，人们的生活方式也随之发生了巨大的改变。营养过剩、缺乏运动、焦虑、吸烟等不良的生活习惯愈发常见，由此导致2型糖尿病、肥胖等代谢性疾病的发病率不断攀升，并出现患病人群年轻化的现象  ［1］ 。2型糖尿病是一种以机体血糖浓度持续过度升高为特征的慢性代谢性疾病，发病率高。随着2型糖尿病病情的恶化，会导致患者的肾脏、心脏、大脑、骨骼肌等多种器官出现相应的并发症，严重危害患者的身体健康，甚至导致患者肢体残障和死亡  ［1］ 。

近年来，2型糖尿病病情发展与骨骼肌之间的关系越来越受到研究者的关注。研究发现，随着 2型 糖尿病病情的发展，患者的骨骼肌会出现肌肉质量流失和力量下降的症状，被认为是2型糖尿病在骨骼肌组织的并发症  ［2］ 。骨骼肌组织是人体的重要组成部分，约占健康成年人体重的40%，并且骨骼肌对于机体的能量代谢具有重要意义。骨骼肌是胰岛素的靶器官和糖原储存的重要场所，对于机体的血糖水平具有关键的调控作用  ［3］ 。此外，骨骼肌质量的变化还会影响机体的基础代谢速率。研究发现，骨骼肌质量在体重中的占比低于32%时，哺乳动物的基础代谢速率处于较低水平  ［4］ 。 2型 糖尿病患者的骨骼肌发生胰岛素抵抗和骨骼肌质量流失，削弱了骨骼肌对血糖的摄取和代谢能力，将进一步加剧机体的代谢综合征和2型糖尿病病情的恶化  ［5］ 。并且2型糖尿病的患病人群主要集中于中老年人，肌肉质量的流失和肌肉力量的减弱会增加患者跌倒、骨折的风险，降低患者的身体活动能力  ［5］ 。因此，维持或增强2型糖尿病患者骨骼肌的质量和力量对于阻止2型糖尿病病情的恶化和改善患者的生活质量具有重要意义。

维持和增强骨骼肌质量和力量的方法已经有了很多的研究报道，但是中老年2型糖尿病患者由于衰老、其他基础性疾病等原因，想要通過抗阻训练来提升肌肉质量存在一定危险性或者难以完成有效的训练量。电刺激是康复医学领域维持和提升患者肌肉质量和力量的有效方法，并且经过不断的研究发展和临床实践，已经形成了具有不同治疗效果和用途并且安全性高的多种电刺激方法，例如神经肌肉电刺激、功能性电刺激等  ［6］ 。电刺激维持和提升肌肉质量、力量的效果已经在过去的研究和临床实践中得到了验证  ［7］ 。但是，电刺激对骨骼肌的干预效果是否也会改善机体的血糖水平仍然缺乏明确的验证。本文通过采用3种不同的电刺激频率（20Hz、40Hz以及100Hz），验证电刺激骨骼肌是否能降低2型糖尿病大鼠的血糖，以及选择出最有效的电刺激干预条件。

除此之外，骨骼肌具有自我再生修复的能力， 2型 糖尿病抑制骨骼肌的再生修复，这也是导致 2型 糖尿病肌肉并发症的重要机制  ［8］ 。骨骼肌的再生修复依赖于骨骼肌组织中的肌肉干细胞又被称为肌卫星细胞。损伤、肌肉锻炼等刺激可以诱导肌卫星细胞的激活，激活后的肌卫星细胞通过增殖、分化、融合对肌纤维损伤部位的进行程序性的再生修复  ［8］ 。研究发现，电刺激通过诱导骨骼肌的收缩，同样可以激活肌卫星细胞对骨骼肌的再生修复  ［9］ 。但是相应的电刺激方案种类繁杂，本文通过使用长时间的低频电刺激（20Hz、40Hz）和间歇性的高频电刺激（100Hz）三种电刺激方案对普通大鼠肌肉进行干预，确定对肌卫星细胞的激活效果最为明显的电刺激方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

实验第一部分，选用SPF级健康雄性SD大鼠50只，体质量200g±10g。本实验所有大鼠均由哈尔滨医科大学实验动物学部提供，许可证号：SCXK（黑）2019-001，室内环境由独立空调风机系统控制，室内通风良好，室温：20℃-22℃，相对湿度：28%～50%。保持实验室环境干净卫生，大鼠自由摄食、饮水。大鼠随机分为空白对照组（n=10）、造模组（n=40）。造模组通过使用高脂饲养联合链脲佐菌素注射2型糖尿病造模，造模过程中死亡2只大鼠，其余38只大鼠全部造模成功。空白对照组的大鼠给予常规饲料喂养，在造模组注射链脲佐菌素时，同时对空白对照组注射等量的生理盐水。造模成功后对符合2型糖尿病成模条件的大鼠随机分为模型组（n=8）、20Hz组（n=10）、40Hz组（n=10）以及100Hz组（n=10），用于不同参数电刺激对2型糖尿病大鼠机体血糖调控的影响研究。

实验第二部分，同样选用相同条件的SPF级健康雄性SD大鼠32只，随机分为空白对照组 （n=8）， 20Hz组（n=8）、40Hz组（n=8）以及100Hz组（n=8），用于不同参数电刺激对大鼠肌卫星细胞激活情况的研究。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法   模型组、20Hz电刺激组、40Hz电刺激组以及100Hz电刺激组进行2型糖尿病造模。 所有大鼠适应性喂养1周后，对上述4个造模组给予高脂饲料喂养8周。高脂饲料饲养8周后，对大鼠进行腹腔注射低剂量链脲佐菌素（35mg/kg.dw）。注射完成72h后测定大鼠空腹血糖≥16.7mmol/L 视为2型糖尿病造模成功  ［13］ 。对照组的大鼠则给予常规饲料喂养以及自由饮水，8周后腹腔注射等量的生理盐水。

1.2.2 电刺激方法  按照石海旺等人的电刺激方案  ［7］ ，使用购自北京众实迪创科技的电刺激仪，通过导线连接华佗牌非一次性针灸针，刺入部位为大鼠双侧后肢骨骼肌。电刺激开始前，将大鼠麻醉并使用大鼠固定器固定，避免电刺激过程中大鼠受到刺激挣扎造成骨骼肌损伤和应激。刺入针灸针前，使用实验动物剃毛器清理大鼠后肢毛发，使用医用酒精棉擦拭大鼠后肢皮肤和针灸针。

电刺激实验计划分成两部分，第一部分使用3种参数条件的肌肉电刺激干预2型糖尿病大鼠，每天干预一次，每干预5天休息一天，电刺激实验持续10周。第二部分使用三种参数条件的肌肉电刺激对普通大鼠进行一次性的电刺激实验，观察不同参数条件的肌肉电刺激对大鼠肌肉中的肌卫星细胞的激活效果。电刺激参数见下表。

1.2.3 空腹血糖浓度（FBG）和口服葡萄糖耐量检测（OGTT）

在电刺激实验开始前和实验结束后对所有大鼠都进行一次空腹血糖浓度和口服葡萄糖耐量的检测，电刺激开始后对20Hz电刺激组、40Hz电刺激组和100Hz电刺激组的所有大鼠每间隔5天检测一次空腹血糖浓度。测定空腹血糖浓度和口服葡萄糖耐量提前14个小时给大鼠禁食，保持自由饮水。空腹血糖浓度和口服糖耐量测试在清晨时进行，采用尾尖取血和三诺血糖仪检测大鼠的空腹血糖浓度。然后给予大鼠20%葡萄糖溶液灌胃（10ml/kg.bw），灌胃后15min、30min、60min、90min和120min时分别测定血糖值并绘制葡萄糖耐量趋势图（见图2），糖耐量曲线下面积比（AUC）采用几何面积相加法。 计算公式为AUC =（1/4×a+1/2×b+3/4×c+1/2×d） ×60（a、b、c、d 分别为 0、30min、60min、120min时刻血糖值）

1.2.4 免疫荧光染色

实验第二部分大鼠肌肉电刺激实验结束后对大鼠后肢腓肠肌进行取样并使用4%多聚甲醛固定，然后将固定好的样本在自来水下进行冲水30min，放入脱水机进行脱水，脱水结束后。样本放入包埋机中，对样本进行石蜡包埋，包埋的蜡块冰镇2h；摊、烤、烘一体机提前预热：摊片50℃，烤片80℃，烘片95℃。之后进行切片，样本切片为4μm。将切好的组织放入摊片槽的水里进行捞片，然后玻片进行烤片30min，烘片15min。之后对切片进行浸泡脱蜡，破膜，洗片，抗原修复中火煮沸10min。之后使用PBST缓冲液洗片， 封闭孵育30min，滴加荧光一抗（PAX7 Antibody； MyoD1 Antibody；MYOG Rabbit pAb ）孵育之后。再次使用PBST洗片后，滴加荧光二抗（Goat anti-Rabbit IgG （H+L） Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody， Alexa Fluor 488）孵育。再次重复PBST洗片后，滴加DAPI对细胞核进行染色孵育。再次洗片后滴加抗荧光淬灭剂后，使用显微镜观察并拍照。

1.3 统计学分析

采用SPSS25.0统计分析软件，多组之间采用单因素方差分析（ANOVA），同组前后采用配对t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义，结果以平均数±标准差（ ±SD）表示。

2 研究结果

2.1 不同电刺激对2型糖尿病大鼠空腹血糖浓度的影响

进行10周肌肉电刺激干预后，三个电刺激组的大鼠的空腹血糖浓度均较模型组显著下降（P＜0.05），但是仍然显著高于空白对照组空腹血糖浓度，说明长期肌肉电刺激大鼠骨骼肌对于2型糖尿病大鼠具有降低血糖的作用，但是并不能恢复至健康大鼠的血糖水平。相较于20Hz电刺激，40Hz电刺激与100Hz电刺激产生的降糖效果更加显著 （P＜ 0.05）。

电刺激实验开始后，每间隔5天对3个电刺激组的大鼠检测一次空腹血糖浓度，所得到的数据整理并绘制如下大鼠空腹血糖浓度变化趋势（图1），可见相较于20Hz电刺激组，40Hz电刺激与100Hz电刺激对2型糖尿病大鼠的降糖效果更加明显。

2.2 不同电刺激对2型糖尿病大鼠血糖曲线下面积（AUC）的影响

口服葡萄糖耐量是诊断2型糖尿病的常用测试方法，糖耐量数据可以反映受试者胰岛β细胞的功能和机体调节血糖浓度的能力。将肌肉电刺激实验结束后模型组与3个电刺激组所测量的口服糖耐量数据整理绘制如下糖耐量趋势图（图2）。

如图所见，与模型组的口服糖耐量趋势相比较，在灌胃葡萄糖溶液30-60 min后，3个电刺激组的大鼠血糖都开始下降，而模型组的大鼠在灌胃后2 h血糖值仍然处于高水平，并且没有出现明显的下降趋势。这说明相较于造模组大鼠，长期肌肉电刺激对2型糖尿病大鼠的葡萄糖耐量產生了一定的改善作用。另外，根据肌肉电刺激干预实验前后所得到的口服葡萄糖耐量数据计算口服葡萄糖耐量曲线下面积（AUC），并进行整理分析（表3）。糖耐量曲线根据口服葡萄糖后不同时刻的血糖浓度进行绘制。糖耐量受损的受试者摄入葡萄糖后，血糖浓度过度升高并且难以恢复至机体摄入葡萄糖前的水平，从而导致其AUC增加。因此，AUC数据的变化可以反映受试者机体糖耐量的改变。

在3种参数条件的肌肉电刺激方案中，40Hz电刺激对2型糖尿病大鼠的糖耐量影响最为显著。与模型组相比，40Hz组大鼠在电刺激实验后，口服葡萄糖耐量曲线下面积得到了显著性的降低，具有统计学意义（P＜0.05）。其余两种肌肉电刺激方案虽然也对2型糖尿病大鼠的口服葡萄糖耐量产生了一定的改善效果，但是它们的AUC数据与模型组相比无统计学差异（P＞0.05）。

2.3 不同电刺激对正常大鼠腓肠肌肌卫星细胞增殖分化的影响

肌卫星细胞的增殖分化受到Pax7和肌生成调节因子MyoD1和MyoG的调控，Pax7、Myod1和Myog也是肌卫星细胞增殖分化过程的标志性蛋白  ［10］ 。对电刺激后取样的普通大鼠肌肉进行免疫荧光染色后，得到以下结果（图3）。与空白对照组相比，3种参数的电刺激实验后，大鼠肌肉中Pax7、MyoD1和MyoG表达阳性的细胞数量均得到显著提高，说明三种参数条件的电刺激方案都可以有效的激活大鼠骨骼肌中的肌卫星细胞。其中100Hz电刺激干预后，大鼠肌肉三种蛋白表达阳性的细胞数量最多，说明100Hz电刺激对大鼠肌肉中的肌卫星细胞的激活效果最为明显（图4）。

3 讨 论

骨骼肌是机体进行糖代谢的重要场所，骨骼肌质量和功能的维持对于机体血糖的调控也具有不可或缺的作用  ［3］ 。通过各种类型的运动去改善机体的能量代谢一直是防治2型糖尿病的核心干预手段。但是，我国2型糖尿病高发于中老年人群体，完成有效的运动训练计划具有一定的难度和危险性。因此，对于无法有效完成自主运动的2型糖尿病患者亟需其他的方式来改善机体血糖控制。

电刺激作为一种物理因子治疗方法是康复医学领域的传统治疗手段，尤其是在肌肉质量的维持和功能康复方面得到广泛的应用，衍生出多种电刺激方法。通过电刺激诱导骨骼肌的主动收缩已经被证明可以改善肌肉的能量代谢。Hamada等人发现通过电刺激诱导受试者下肢肌肉收缩可以增强受试者机体的能量消耗和机体对葡萄糖的吸收和氧化代谢  ［11］ 。因此，根据前人的研究，电刺激可以作为抗阻运动、高强度间歇训练等运动干预方式的潜在的替代方法或者辅助手段，作为另外一种选择应用于2型糖尿病患者的机体血糖调控。本文比较了不同参数条件的肌肉电刺激对2型糖尿病大鼠机体血糖调控的改善效果，验证了肌肉电刺激的确具有降低2型糖尿病大鼠空腹血糖浓度和改善葡萄糖耐量的效果。并且，通过比较不同参数产生的改善效果，发现40Hz电刺激对2型糖尿病大鼠血糖调控的改善效果最为显著，不仅降低空腹血糖浓度的效果最为明显，而且对2型糖尿病大鼠的葡萄糖耐量也具有显著的改善效果。100Hz电刺激对于2型糖尿病大鼠的空腹血糖浓度也具有显著的降低效果，但是对于大鼠的葡萄糖耐量的改善并没有达到具有统计学意义的程度。出现这种结果可能与不同参数电刺激诱发的肌肉主动收缩的强度、时间不同有关  ［12］ 。100Hz电刺激，电压强度更高因此募集的运动单位更多，并且循环间断式的输出脉冲刺激，也会导致大鼠肌肉间断式的激发肌肉收缩，这种肌肉收缩方式类似于肌肉力量训练或高强度间歇训练时的肌肉收缩。相较于100Hz电刺激，20Hz电刺激和40Hz刺激的电压强度较低，脉冲输出持续60min不间断的进行，肌肉收缩类似于耐力训练。因此，40Hz电刺激相较于20Hz电刺激，在相同的时间内，40Hz电刺激输出的脉冲次数多，引起的肌肉收缩频率同样也高于20Hz电刺激。这可能导致完成相同时间的一次电刺激，40Hz电刺激消耗的血糖高于20Hz电刺激。而相对于引起高强度间歇式肌肉收缩的100Hz电刺激，40Hz电刺激引起的肌肉收缩所持续的时间更长，这也可能也会造成40Hz电刺激消耗的血糖高于100Hz电刺激。经过10周电刺激干预实验的累加效应后，最终使得40Hz电刺激对糖尿病大鼠的机体血糖调控的改善效果更加显著。

另外，电刺激与运动一样对于肌肉卫星细胞的激活同样具有显著的效果，这也是电刺激维持、增加骨骼肌容量的机制之一  ［13］ 。肌卫星细胞是骨骼肌组织中的干细胞，当骨骼肌受到运动、损伤等刺激时，肌卫星细胞从静止状态中激活，并进入增殖分化过程，最终分化成为肌管对受损的肌纤维进行修补或者融合形成新的肌纤维  ［14］ 。肌卫星细胞数量减少和功能受抑制也是2型糖尿病患者和中老年人出现肌肉质量流失、肌肉萎缩的重要机制  ［19］ 。本文通过比较了不同参数条件的电刺激对大鼠下肢骨骼肌中的肌卫星细胞的激活情况。对电刺激后24h取样的大鼠骨骼肌切片进行免疫荧光染色，绿色荧光选择调控肌卫星细胞增殖分化过程的 3个 特异性蛋白Pax7、Myod1和Myog  ［10］ 。发现20Hz、40Hz和100Hz电刺激对大鼠肌卫星细胞都具有激活的效果，其中100Hz的激活效果最为明显。正如前面所述，100Hz电刺激强度更高，募集的运动单位更多，激发的肌肉收缩也更加类似于肌肉力量训练，这可能就是100Hz电刺激相较于强度较低的20Hz电刺激和100Hz电刺激对大鼠肌卫星细胞的激活效果更明显的原因。

肌卫星细胞作为肌肉再生修复的主要承担者，激活后的肌卫星细胞通过与受损肌纤维融合来修补破损的肌纤维膜，从而维持肌纤维膜的完整性。此外，与肌纤维融合的肌卫星细胞会贡献出自己的细胞核来适应肌纤维损伤修复以及肌纤维肥厚过程中伴随的“肌核域”变化（肌纤维是多核细胞，每个肌细胞核在转录上只能控制有限的细胞质区域，被称为肌核域）  ［15］ 。可见肌卫星细胞可以对肌纤维进行从肌纤维膜到肌细胞核的完整修复再生。肌卫星细胞的再生修复能否重塑肌纤维的胰岛素受体从而改善肌纤维的胰岛素抵抗情况，这个思路是令人感兴趣的。换言之能否通过抗阻运动、肌肉电刺激等干预方式来激活2型糖尿病患者的肌肉组织中的肌卫星细胞，从而重塑肌纤维膜上的胰岛素受体和胰岛素主导的肌肉摄取葡萄糖的信号通路。尽管目前缺乏确凿的证据来证明，经过肌卫星细胞修复后的肌纤维膜上的胰岛素受体是否得到重塑，但这为改善2型糖尿病患者肌肉组织的胰岛素抵抗情况提供了新的研究思路。

4 结 论

本研究探讨了不同肌肉电刺激条件诱导骨骼肌收缩对2型糖尿病大鼠血糖调控以及对健康大鼠肌卫星细胞激活的效果。实验结果显示20Hz、40Hz和100Hz电刺激均能有效改善大鼠机体血糖调控，并且确定了40Hz是改善大鼠机体血糖调控最有效的参数条件。电刺激可以有效的激活大鼠骨骼肌中的肌卫星细胞，而对肌卫星细胞激活效果最显著的是100Hz电刺激。

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