发酵蔬菜中乳酸菌分离及其耐酸耐胆盐特性分析

郑秋霞 李自强 吴丽云

摘 要：为获得优良的耐酸耐胆盐乳酸菌菌株，从市售发酵蔬菜样品中分离乳酸菌，通过形态学观察以及糖发酵试验对其进行初步鉴定，并开展耐酸耐胆盐初筛及人工胃肠液复筛试验。结果表明：分离出的18株乳酸菌菌株中，有11株具有较高的耐酸耐胆盐能力；经过人工胃肠液复筛后，存活率高于30%的有4株，其中cf12菌株在人工胃液中存活率达到95%，人工肠液处理4、8 h后的存活率分别为173%、194%，菌液浓度未有下降反而有所增加，说明该菌株对低酸性环境及高胆盐环境均具有较强的耐受能力。4株乳酸菌经16S rDNA分子生物学鉴定表明，菌株cf10为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，菌株cf9、cf12为短乳杆菌Lactobacillus brevis，菌株cf18为副短乳杆菌Lactobacillus parabrevis。

关键词：发酵蔬菜；乳酸菌；分离；耐酸；耐胆盐

中图分类号：TS 255   文献标志码：A   文章编号：0253-2301（2023）02-0028-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.02.005

Abstract： In order to obtain the lactic acid bacteria strains with excellent acid and bile salt tolerance， the lactic acid bacteria were isolated from the commercial fermented vegetable samples and preliminarily identified by using the morphological observation and sugar fermentation test. Then， the screening of acid and bile salt resistance and the rescreening test of artificial gastrointestinal juice were carried out. The results showed that 11 of the 18 strains of lactic acid bacteria had high acid and bile salt tolerance. After the rescreening of artificial gastrointestinal juice， the survival rate of 4 strains was higher than 30%， and the survival rate of the strain cf12 in artificial gastric juice reached 95%. The survival rates of the strains treated with the artificial intestinal juice for 4 h and 8 h were 173% and 194%， respectively. The concentration of bacterial suspension did not decrease but increased， indicating that the strain had strong tolerance to the low acidic environment and high bile salt environment. The 16S rDNA molecular biological identification of the four strains of lactic acid bacteria showed that the strain cf10 was Lactobacillus plantarum， the strains cf9 and cf12 were Lactobacillus brevis， and the strain cf18 was Lactobacillus parabrevis.

Key words： Fermented vegetables； Lactic acid bacteria； Isolation； Acid tolerance； Bile salt tolerance

發酵蔬菜有着悠久的历史，是以蔬菜为原料，利用微生物进行发酵的传统食品。其不仅保留蔬菜的营养成分如氨基酸、膳食纤维和维生素C等营养物质，而且富含乳酸菌、酵母、醋酸杆菌等功能微生物，其中以乳酸菌尤为多样丰富，是分离获得乳酸菌菌株的理想材料[1-3]。近年来，以发酵蔬菜制品为材料分离各类乳酸菌的报道屡见不鲜。聂紫玉等[4]以传统发酵蔬菜为材料分离筛选获得19株无溶血性、不产生生物胺、安全性较高的乳酸菌。张会生等[5]从泡菜中分离获得的植物乳杆菌NCU001210、乳酸乳球菌NCU036015、肠膜明串珠菌NCU018046，在人工胃肠液中的存活率能达到85%以上。曾维友等[6]从泡菜中分离获得的植物乳杆菌S78能够耐受pH3.0的人工胃液和0.3%的胆盐环境。

乳酸菌具有抑制有害微生物生长、维持肠道微生态动态平衡、增强机体免疫力、提高动物生产性能等诸多功能[7-10]。含有较高耐酸耐胆盐能力的乳酸菌发酵食品经人体食用后，其乳酸菌能够在肠胃中存活，有利于发挥乳酸菌的益生特性[11-14]，因而筛选获得具有优良的耐酸耐胆盐特性的乳酸菌菌株具较大的应用前景。本研究采用形态学观察及理化特性试验从市售发酵蔬菜中分离乳酸菌，并对菌株开展耐酸耐胆盐特性、人工肠胃液耐受性试验，以及16S rDNA分子生物学鉴定，以期获得性状优良的耐酸耐胆盐乳酸菌菌株，为菌株后续进一步开发利用提供数据支撑和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

福州市永辉超市及沃尔玛超市市售发酵蔬菜。

1.2 试剂和仪器

MRS培养基（青岛海博生物技术有限公司）；牛胆盐（麦克林试剂）；胃蛋白酶（猪源）、胰蛋白酶（猪源）（上海源叶生物科技有限公司）。

BINDER恒温培养箱（德国宾德公司）；759S紫外可见光分光光度计（上海棱光技术有限公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；实验室pH计［梅特勒托利多科技（中国）有限公司］。

1.3 培养基配制

（1）基础培养基：MRS液体培养基；在基础培养基中添加1.5%的琼脂作为分离培养基。（2）耐酸试验培养基：1 mol·L-1的盐酸溶液调节基础培养基的pH值至3.0。（3）耐胆盐试验培养基：在基礎培养基中，添加过滤除菌后的牛胆盐，使其终浓度为0.3%。（4）人工胃液及人工肠液：参照孙宁等[15]的方法进行配制。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵蔬菜中乳酸菌分离 随机选取市售的酸菜样品，称取10 g样品加入生理盐水中，稀释至10-8，依次涂布至MRS平板上，37℃厌氧培养48 h。选取适宜的浓度挑取单菌落进行划线纯化，直至菌落大小一致，简单染色镜检后菌体形态一致。

1.2.2 菌株形态观察及生理生化鉴定 根据《伯杰氏细菌鉴定手册》[16]及《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[17]对分离获得菌株进行形态观察及糖发酵试验。

1.2.3 菌株耐酸能力初筛 根据姜美娜[18]的方法将连续活化2代的种子液以2%浓度接种至pH3.0的MRS液体培养基中，37℃培养24 h，分别取0、24 h的培养液测定其在600 nm波长下的吸光值，并取50 μL培养液涂布于MRS平板上观察生长情况。

1.2.4 菌株耐胆盐能力初筛 连续活化2代的种子液以2%浓度接种至含0.3%胆盐的MRS培养基中，37℃培养24 h，分别取0、24 h的培养液测定其在600 nm波长下的吸光值，并取50 μL培养液涂布于MRS平板上观察生长情况。

1.2.5 菌株人工胃肠液复筛 取1 mL经耐酸耐胆盐初筛后的菌株种子液接种至9 mL人工胃液中，37℃培养3 h，对0 h及3 h的培养液进行活菌计数并计算存活率。选择存活率大于30%的菌株，取1 mL经人工胃液培养3 h后的菌液，接种至9 mL人工肠液中，37℃培养8 h，对0 、4 、8 h后的培养液进行活菌计数并计算存活率。

1.2.6 分子鉴定 选择生物工程（上海）有限公司试剂盒对菌株进行DNA提取，以16S rDNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增。将扩增产物送至生物工程（上海）有限责任公司进行测序，测序结果在NCBI基因库中进行比对。

2 结果与分析

2.1 发酵蔬菜中乳酸菌菌株分离结果

由表1、图1可知，从样品中分离纯化获得18株菌株，均为革兰氏阳性菌。将分离获得的菌株进行糖发酵试验，对比《伯杰氏细菌鉴定手册》可将18株菌株初步归为乳酸菌（表2）。

2.2 分离乳酸菌菌株耐酸初筛结果

乳酸菌能够发挥其益生作用是以在胃肠液中存活为前提条件，胃液中含有大量的胃蛋白酶和盐酸，在空腹时pH值可低至1.5～2.0，而进食后可升至pH3.5左右，因而菌株的耐酸能力越高，在胃液中的存活率越高。

由表3可知，在pH3.0的MRS培养基中培养24 h后，与0 h相比菌株在600 nm波长下的吸光度差值高于0.05的菌株有9株，涂布于平板后菌株仍可生长，说明这9株菌株对低酸性环境有一定的耐受能力。

2.3 分离乳酸菌菌株耐胆盐的初筛结果

由表4可知，在含有0.3%胆盐的MRS培养基中培养24 h后，与0 h相比菌株在600 nm波长下的吸光度差值高于0.05的菌株有11株。其中菌株cf7、cf10、cf11、cf16的吸光值达到0.2以上，说明其在含有胆盐的培养基中能较好地增殖，对胆盐的耐受程度较高。cf1虽对酸性环境的耐受能力较弱，但对胆盐仍有一定的耐受能力。故共有11株菌株能够耐受0.3%的胆盐。

2.4 耐酸耐胆盐乳酸菌菌株的人工胃肠液复筛

由表5可知，受试菌株中cf1、cf9、cf10、cf12、cf18的存活率在30%以上，其中cf12在人工胃液中的存活率最高，达到95%，其他菌株按照存活率大小依次为cf1、cf18、cf9、cf10。

由表6可知，11株菌株在肠液中均能存活，cf7、cf9、cf12、cf10、cf15、cf16和cf18这7株菌在人工肠液处理8 h存活率仍然大于30%。其中菌株cf7、cf9、cf12在肠液中的存活率最高，与未经肠液处理时相比菌液浓度不变甚至有所上升，其余菌株的菌液浓度随处理时间的延长而有所下降。菌株cf1、cf11、cf13、cf17在肠液中存活率最低。

2.5 耐酸耐胆盐乳酸菌菌株分子鉴定结果

选取在人工胃液和人工肠液中存活率均大于30%的菌株cf9、cf10、cf12、cf18作为优良菌株，提取DNA 并进行PCR扩增，通过16S rDNA测序后，经NCBI基因库中比对其相似度在99%以上，经鉴定菌株cf10为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，菌株cf9、cf12为短乳杆菌Lactobacillus brevis，菌株cf18为副短乳杆菌Lactobacillus parabrevis。

3 结论与讨论

本研究从市售发酵蔬菜食品中分离出18株菌，经菌株形态观察和生理生化试验初步鉴定为乳酸菌。通过对18株菌株的耐酸能力和耐胆盐能力进行分析，发现有9株菌株对低酸性环境有较好的耐受能力，有11株菌株能够耐受高浓度的胆盐环境。因乳酸菌在胃液中只是短暂停留，要在肠道中存活仍需经受肠液的消化作用[19-20]，而肠道消化液的主要成分为胆盐及胰液[18]，乳酸菌对胆盐的耐受程度越高，在肠道中的存活率越高，所以选择11株菌株进行人工肠胃液的复筛试验。结果表明有4株菌株在人工肠胃液的存活率均高于30%，其中菌株cf12在人工胃液中的存活率达到95%，在人工肠液中存活率达到173%（4 h）和194%（8 h）。最后对4株菌株进行分子生物学鉴定及同源性比对可知，1株植物乳杆菌cf10，2株短乳杆菌cf9、cf12，1株副短乳杆菌cf18。

乳酸菌对人工胃液和人工肠液的耐受能力，能够确保其通过胃部的高酸环境并能在肠道消化液中保持一定的活性[21]，本研究筛选获得的乳酸菌具有耐酸耐胆盐能力，具备研究开发的潜力，后续将对其开展进一步的功能性研究。

参考文献：

[1]黄慧福，宁丹，杨诚睿.传统富源酸菜中优质乳酸菌的筛选及应用[J].食品研究与开发，2023，44（4）：197-202.

[2]CHOI A R.PATRA J K，KIM W J，et al.Antagonistic activitiesand probiotic potential of lactic acid bacteria derived from a plantbased fermented food[J].Frontiers in Microbiology，2018，9：1963.

[3]刘长根.我国传统发酵蔬菜微生物多样性比较[D].南昌：南昌大学，2019.

[4]聂紫玉，吴艳阳，王增光，等.植物源益生乳酸菌的筛选及其特性[J].食品科学，2022，43（18）：143-151.

[5]张会生，熊涛.三株乳酸菌的鉴定及益生性能[J].南昌大学学报（理科版），2019，43（4）：336-341.

[6]曾维友，周於强，池浩.泡菜中乳酸菌的分离鉴定及抗性筛选[J].中国酿造，2021，40（10）：163-167.

[7]夏勒合特·巴克尔拜，刘晶晶，贺红军，等.新疆传统泡菜中乳酸菌的分离鉴定及其益生性能评价[J].保鲜与加工，2021，21（11）：87-93.

[8]李献华，王许刚，高晶萍，等.乳酸菌的生物学功能及其在家禽养殖生产中应用的研究进展[J].饲料研究，2022，45（14）：121-124.

[9]田珂雪，陈雪洋.乳酸菌益生功能及其在食品中的应用综述[J].河南农业，2020， 551（27）：43-45.

[10]解文利.贵州吉林传统发酵蔬菜微生物多样性及其乳酸菌抗氧化功能评估[D].贵阳：贵州大学，2021.

[11]柳青.具有潜在益生特性乳酸菌的筛选鉴定及其特性研究[D]. 呼和浩特：内蒙古农业大学，2018.

[12]张琳，荆海晓.乳酸菌菌株分离及益生效果评价[J].中国调味品，2022，47（9）：68-71.

[13]赵鑫，胡蝶，张素平，等.传统泡菜中乳酸菌的筛选鉴定及抗氧化特性分析[J].中国调味品，2022，47（2）：5-9.

[14]罗强，李幸洋，陈炼红，等.传统发酵泡菜中乳酸菌种群组成及优良菌株产酸耐酸特性分析[J].食品科学，2021，42（2）：158-163.

[15]孙宁，雷敬玲，吴晓青，等.自然发酵酸笋中乳酸菌的筛选鉴定及益生特性研究[J].中国酿造，2020，39（6）：63-68.

[16]BUCHANAN R E.中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组译.伯杰细菌鉴定手册[M].北京：科学出版社，1984.

[17]凌代文，东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及试验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999.

[18]姜美娜.朝鲜族传统发酵食品中耐酸乳酸菌的分离筛选及益生特性研究[D].吉林：延边大学，2020.

[19]陈霞.具有益生功能的Bifidobacterium animalis subsp.lactisV9 的安全性评估、生理功效及其全基因组学研究[D].内蒙古：内蒙古农业大学，2010.

[20]刘舒展.瑞士乳杆菌NS8抗癌活性及其机制的初步探讨[D].浙江：杭州师范大学，2017.

[21]冯金晓，李明珠，李翠萍，等.传统泡菜中两株耐酸性乳酸菌的分離与鉴定[J].食品与机械，2021，37（5）：22-26.

（责任编辑：柯文辉）