‘海大2号’菠萝蜜茎尖组培褐变过程中酚类物质及相关酶活性的影响

丁燕　郭佳慧　范紫云　向星星　干雨露　闵天雨　杨廷　丰锋　叶春海

关键词：菠萝蜜；组织培养；褐化；抗褐化剂

中图分类号：S667.8 文献标识码：A

菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.），属于桑科木菠萝属的热带果树，常绿乔木，是一种集食用、药用、木本粮食于一身的多用途经济树种[1]，因果实甜美而受到欢迎，市场前景广阔。大量研究表明，菠萝蜜的叶、茎、种子和果肉具有较高的药用、食用价值[2]。

目前，菠萝蜜的繁殖方式主要有实生繁殖、嫁接繁殖和组织培养[3]。由于实生繁殖后代易发生性状分离而难以保存木本优良性状等问题，导致果实品味和品质发生较大改变[4]。目前生产上主要采取嫁接繁殖的方法，此方法可以保存母本优良性状。但因菠萝蜜存在流胶较多的特性，嫁接时创面极易被胶污染，成活率受到严重影响[5]。

组织培养可加快植物的繁殖速度，在短期内获得大量遗传性一致的种苗，并使其保持母本优良的性状，更有利于新品种的选育[10]，目前在香蕉、桉树、蝴蝶兰等植物上得到广泛应用。前人曾利用菠萝蜜嫩茎等外植体通过组织培养获得试管苗[7-9]。但利用成年菠萝蜜树茎尖来进行繁殖尚无报道。1960年，MOREL[10]就利用大花穗兰的茎尖成功诱导分化出植株。利用此技术于‘海大2 号组培快繁中发现，菠萝蜜组织培养过程中褐化严重，导致其难以建立无性繁殖体系，产业化生产难以实现。

周亚辉等[11]研究认为，组培褐化机制可分为酶促褐变和非酶促褐变2 种，菠萝蜜外植体的褐变主要是酶促褐变，在氧化酶催化下酚类物质形成褐色的醌类及其聚合物称为酶促褐变。牛佳佳等[12]研究认为，醌类化合物的产生会使得外植体的伤口处变深褐色，这些褐色物质产生后会慢慢渗透到培养基中，来达到抑制其他酶活性产生这一目的，植株在吸收营养物质时受到阻止，导致外植体褐变而死亡，植株的生长受到影响。

菠萝蜜组织培养快繁全过程的理论和技术已基本成熟，然而在实际生产上却难于重复和推广[13]。为尽早实现菠萝蜜的工厂化繁殖，为获得大量优质苗木而奠定基础，本研究以菠萝蜜茎尖为材料，探究经过不同低温（4 ℃）处理后及不同浓度PVP 对外植体褐化的影响，并测定各处理下茎尖PPO 活性、酚类物质含量，以此更深入地了解菠萝蜜组织培养褐化的因素，探究褐化的机理。旨在促进菠萝蜜组培快繁技术体系的建立，以期为构建菠萝蜜种苗繁育技术体系及其产业化生产示范提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究试验材料‘海大2 号菠萝蜜外植体来自广东海洋大学后山园林基地，选取长势强壮，无病虫害的植株，在晴天早晨进行采摘。实验培养基采用1/2 MS 培养基，NAA 0.1 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂5.5～6.0 g/L，pH 5.8，培养温度（24±1） ℃，光照强度2000 Lx，光照10 h/d。实验中所用药剂均来自麦克林公司及广州试剂厂。

经过表面灭菌处理后，将外植体依次接种至灭菌培养基中，每个处理接种30 瓶，每瓶接种1个顶芽，3 次重复。15 d 后统计菠萝蜜外植体的污染率和褐化率。低温（4 ℃）处理时间分别设定为12、24、48 h，15 d 后分别统计其褐化率及萌芽率，并测定其PPO 活性及酚类物质含量[6， 14]。

外植体经过12～24 h 的低温处理后将接入不同浓度的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）培养基中，15 d后分别统计其褐化率及萌芽率，并测定其PPO 活性及酚类物质含量。

1.2 方法

外植体底部褐色色块超过0.1～0.5 cm 均为褐化（图1）。采用以下诱导评价公式计算萌芽率及褐化率。

萌芽率=诱导出腋芽的瓶数/同批次接种的外植体瓶数×100%

褐化率=褐化的外植体数/同批次接种的外植体瓶数×100%

1.3 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2007 软件对重复样的平均值与标准差进行计算，采用DPS 7.05软件和Duncans 分析法对不同指标进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同低温预处理时间对菠萝蜜茎尖组培褐化的影响

如表1 所示，未进行低温处理的外植体，褐化率高达58.89%，萌芽率为38.89%。随着低温处理时间的延长，其褐化率显著降低。低温处理12 h，外植体的褐化率为46.67%，与其他处理相比，差异显著。低温处理24 h，萌芽率最高，达到57.78%，与对照组相比，差异显著。结果表明，采集后的菠萝蜜外植体经过一定的低温预处理后，对其褐化率及萌芽率影响显著（图2）。

2.2 不同PVP浓度对菠萝蜜茎尖组培褐化的影响

如表2 所示，PVP 的添加对菠萝蜜外植体褐化及萌芽率的影响显著。PVP 浓度为2.0 g/L 时，褐化率最低，萌芽率最高，分别为15.56%和66.67%，与对照组相比，褐化率降低了41.11%，萌芽率升高了30.00%，差異显著。结果表明，PVP对菠萝蜜外植体的褐化能够起到抑制作用，且在浓度为2.0 g/L 时，效果最佳。具体生长情况见图3，验证效果见图4。

2.3 不同低温预处理时间对‘海大2 号菠萝蜜茎尖PPO 活性、总酚及总黄酮含量的影响

2.3.1 PPO 活性 如图5A 所示，‘海大2 号菠萝蜜茎尖在经过低温处理后，体内PPO 的活性并未出现下降的趋势，各处理组均高于对照，且随着低温处理时间的延长，体内PPO 活性随之增加，在低温处理48 h 时，PPO 活性达到最高值，为229.07 U/（gmin），且各处理与对照组相比，差异显著。

2.3.2 总酚含量 如图5B 所示，‘海大2 号菠萝蜜茎尖在经过低温处理后，与对照组相比，呈现先降低后升高的趋势。低温处理12 h 和24 h，其体内的总酚含量与对照组相比有下降的趋势，且在低温处理12 h 时达到最低值，为35.47 mg/g，与对照组相比下降了13.56%。在低温处理48 h后，茎尖的总酚含量高于对照组。

2.3.3 总黄酮含量 如图5C 所示，菠萝蜜茎尖在经过低温处理后，外植体体内黄酮的含量均呈现不同程度的降低，与对照组相比差异显著。在低温处理24 h 后，菠萝蜜外植体体内的总黄酮含量最低，为40.04 mg/g，与对照组相比下降37.25 mg/g。低温处理12 h 和48 h 后，外植体总黄酮含量与对照组相比分别降低21.62%和8.72%。

2.4 不同PVP 浓度对‘海大2 号菠萝蜜茎尖PPO 活性、总酚及总黄酮含量的影响

2.4.1 PPO 活性 如图6A 所示，培养基中添加PVP 后，菠萝蜜外植体内PPO 活性与对照组相比，差异显著，当添加浓度为2.0 g/L 时，PPO 活性最低，为82.67 U/（gmin），与对照组相比降低了318.66 U/（gmin）。其他处理组与对照组相比，PPO活性均有不同程度的降低，且与对照组相比分别降低了185.06、70.66 U/（gmin）。

2.4.2 总酚含量 如图6B 所示，当添加浓度为1.0 g/L 时，总酚含量与对照组相比无明显差异。添加的PVP 浓度为2.0 g/L 时，菠萝蜜茎尖总酚含量最低，为28.46 mg/g，与对照组相比降低了25.90 mg/g，差异显著。添加的PVP 浓度为3.0 g/L时，与对照组相比总酚含量下降了11.79 mg/g。

2.4.3 总黄酮含量 如图6C 所示，PVP 添加后，外植体的总黄酮含量显著降低。PVP 浓度为1.0 g/L时，外植体的总黄酮含量与对照组相比降低了19.21 mg/g。PVP 浓度为2.0 g/L 时，菠萝蜜外植体总黄酮含量达到最低值，为17.21 mg/g。PVP 浓度为3.0 g/L 时，外植体的总黄酮含量与对照组相比降低了33.06 mg/g。各处理组与对照组相比，差异显著。

3 讨论与结论

3.1 讨论

菠萝蜜茎尖组织培养中，经过低温处理后能够有效地降低褐化。前人研究发现，外植体在高温培养下，褐变加剧，而降低培养温度后发现，褐化得到明显的改善，这与本试驗研究结果一致[15-16]。喻娜[17]研究认为，低温组培下的外植体有利于降低褐化，刘兰英[15]在核桃组织培养过程中发现，低温下进行组织培养可降低褐化，罗丽华[16]在板栗愈伤组织培养中研究发现，低温处理可减轻外植体褐化的现象。在本研究中，菠萝蜜外植体进行一定时间的低温预处理后，与对照组相比，外植体体内的总酚及总黄酮含量显著降低，试验结果与前人研究结果一致，即适当的低温处理有利于外植体褐化率的降低。

PVP 添加后，发现不同浓度的PVP 均能降低外植体的褐化，这与刘英[18]研究结果一致。目前普遍认为，外植体的褐化与多酚氧化酶（PPO）对酚的作用有关，乜兰春等[19]研究认为PPO 是酚类催化反应的关键酶，因为酚会氧化形成醌[20]，醌会导致外植体的褐化，目前很多学者认为这是导致褐化的主要原因，但不是唯一的原因，众多学者一直就这方面进行研究与探讨，但目前还未得到一致结论。酚酸、类黄酮和单宁是酚类物质结构的三大类化合物，这三大类化合物在褐变过程中充当着重要的角色[21]。印芳[22]研究认为，蝴蝶兰的褐化与酚酸类物质有关，刘红[23]研究结果表明，各处理下的外植体总酚含量与褐化程度呈正相关，即褐化越重，总酚含量越高，本研究也得到了同样结果。

前人研究表明，辣椒和葡萄的褐化可用硝酸银缓解[24-25]，焦金凤[26]认为，合适的抗褐化剂物质有利于降低植物组织培养过程中出现的褐化问题，植物组培养中常用的抗褐化剂根据其作用机理可分为两大类型：（1）防止酚氧化的抗氧化剂，如，VC、Na₂S₂O₃、CA 等；（2）用来吸附醌类物质的吸附剂，如AC、PVP 等。本研究结果表明，添加PVP 2.0 g/L 时用菠萝蜜组织培养抗褐化的效果最好，这可能是因为同一种褐化剂的不同浓度起到的抗褐化效果不一样[26]，张俊林等[27]在核桃组培中，JAIN 等[28]在欧洲李组织培养中研究发现，抑制植物组培褐化效果最好的抗褐化剂是PVP，本试验在添加2.0 g/L PVP 时，对抑制菠萝蜜茎尖褐化起到了较好的效果。张小红等[29]在对核桃进行组织培养中发现，Na₂S₂O₃抑制植物组培褐化效果最好。刘霞等[30]研究发现，培养基中添加AC 对乌龙子根芽眼组织培养的效果最好，由此可见，不同植物的外植体、取材时间、部位等均会影响抗褐化剂的效果[26]。本研究结果表明，酚类物质的含量与褐变程度呈正比，这与许传俊等[31]在蝴蝶兰的研究中、毛沛琪[6]在牡丹等的研究中结果一致。此外，前人研究表明，降低酚类物质即可降低褐化[32-33]，本研究结果也反映出了这一现象。

3.2 结论

本研究以‘ 海大2 号菠萝蜜茎尖为试验材料，分析了低温预处理后菠萝蜜的茎尖及不同浓度PVP 对菠萝蜜茎尖PPO 活性、总酚及总黄酮含量的影响，研究结果表明：在低温处理12 h，菠萝蜜外植体总酚含量最低，低温处理24 h，外植体总黄酮含量最低。茎尖经过12～24 h 低温处理后再接入添加2.0 g/L PVP 的1/2 MS 培养基中，这一浓度下菠萝蜜外植体的褐化率最低且萌芽率最高，且验证结果表明，此方法有利于菠萝蜜茎尖的增殖。

本试验对菠萝蜜外植体组培过程中褐化的抑制进行了研究，初步探索了菠萝蜜外植体在组培过程中影响褐化的一些外部因素，且对部分影响较大的因素如总酚、总黄酮及多酚氧化酶进行了指标的测定，菠萝蜜褐变的研究是一项长期而又艰巨的任务，菠萝蜜组织培养技术还不够成熟，其增殖及生根体系等有待进一步研究，希望今后可以进行深入的研究，加大对醌类物质的鉴定分析。