新型ISSR分子标记鉴别香菇双单杂合子

吴圣进　张芳芳　陈雪凤　刘增亮　张雯龙

关键词：香菇；新型ISSR；双单杂交；杂合子；分子鉴别

中图分类号：S961.6 文献标识码：A

香菇是我国传统的菜肴，其味道鲜美、营养丰富，深受人们的喜爱。香菇的人工栽培历史悠久，近20 年得到迅猛发展，已成为我国栽培规模最大的食用菌品种，年产量达900 多万t[1]。我国培育出的优良香菇品种不断增长，为香菇产业的快速发展做出了卓越贡献[2]。

香菇杂交育种是其新品种选育中最常用、最有效的技术手段，主要包括单单杂交与双单杂交2 种方法。双单杂交是以2 个亲本中的一个亲本的单核体作为受体，以能提供所需优良性状的另一个亲本双核菌株为供体，其一个核进入受体细胞完成配对的非对称杂交方法。双单杂交具有杂交后代筛选工作量相对少、育种周期相对短等优点，从而被广泛应用[3-6]。

杂交后代的鉴定筛选是香菇杂交育种过程中的关键步骤之一，传统方法通过拮抗试验和显微观察菌丝是否存在锁状联合结构进行判别，非常费时、费工，而且效率低、误判率高。随着分子生物技术的快速发展，分子标记技术被越来越多的应用于食用菌杂交育种中，其中ISSR（intersimplesequence repeat）作为一种常用的分子标记，具有稳定性好、可重复性高、引物通用等优点，被广泛应用于食用菌的遗传差异分析[7-9]。ISSR 标记已成功应用于香菇单孢杂交后代的分析，王丽宁等[10]应用ISSR 标记分析耐高温的香菇单孢杂交子时，发现与亲本存在一定遗传差异；宋莹等[11]利用ISSR 标记分析发现，香菇单孢杂交菌株0912 同时含有2 个香菇亲本菌株的特异性条带，从而判定0912 为两亲本的杂交后代；陈世通等[12]利用ISSR 标记成功从84 个香菇单孢杂交菌株中筛选出45 个真正的杂合子。本研究将ISSR分子标记技术拓展应用于香菇双单杂交后代的鉴别筛选，同时通过区分供体核对杂交子进行归类分组，以期为香菇优异单核体菌株材料的创制和筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

香菇亲本菌株808 和YX7 均由广西壮族自治区农业科学院微生物研究所提供。菌株808 是广西推广栽培品种，具有外观品质好，栽培产量高等优良性状；菌株YX7 是广西农业科学院微生物研究所分离驯化自广西野生香菇的菌株，具有较耐高温、香味浓、出菇早等优良性状。PDA 培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 孢子单核体菌株的获取 亲本香菇菌株808 栽培出菇后，选择菇形圆整、开伞七八分的子实体，在无菌环境下采集孢子。采用稀释涂板法分离单孢子[10， 13]，菌丝萌发并纯化一次后，显微镜检测3 次无锁状联合结构的判定为单孢菌株，试管培养保存备用。

1.2.2 双单杂交及杂交菌株的获得 参照程爽爽等[14]的方法，将分离自菌株808 的不同孢子单核体菌株，分别与供体亲本双核菌株YX7 同时接种到PDA 平板上进行两两配对杂交，两菌株接种点相距1.5 cm，于25℃下培养15 d，挑取单核体菌株远离供体亲本菌株一边的菌丝块接种于新的PDA 平板上纯化2 次，保存，作为候选杂交菌株。

1.2.3 杂交子的镜检和拮抗试验 挑取候选杂交菌株菌落边缘不同部位菌丝，置于显微镜下观察是否存在锁状联合结构。同时挑取候选杂交菌株菌丝块，接种于新的PDA 平板上，分别与2 个亲本菌株对峙，于25℃下培养15 d，观察候选杂交菌株与两亲本菌株的拮抗反应情况。

1.2.4 ISSR 分析 将亲本菌株和候选杂交菌株分别接种至铺有玻璃纸的PDA 平板上，于25℃下培养10 d，收集菌丝，采用吴圣进等[9]的方法提取基因组总DNA。ISSR-PCR 反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 10 μL ， Primer 1 μL（10 μmol/L），模板DNA 1 μL（150 ng），ddH2O8 μL。PCR 反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，按表1 所列退火温度下复性45 s，72℃延伸90 s，循环35 次；72℃延伸7 min，4℃保存。扩增产物采用含有GelRed 染料的1.0%琼脂糖凝胶电泳，并于凝胶成像系统中观察拍照。

1.2.5 ISSR 综合分析 首先比较2 个亲本菌株间的条带（图1），相同ISSR 引物下，2 个亲本菌株的PCR 电泳条带中，仅菌株808 拥有的DNA 条带为该菌株的特异性条带（图1 中的箭頭a 所示条带）；与此相同，仅菌株YX7 拥有的DNA 条带则为菌株YX7 的特异性条带（图1 中的箭头b 所示条带）；相同大小位置，菌株YX7 和808 都有的DNA 条带设为共同条带（图1 中的箭头c 所示条带）。检测记录每个杂交子菌株的电泳图谱是（标记为●）否（标记为○）存在上述3 类条带。如图1 中杂交菌株1、2 和7 拥有3 类条带（菌株808 和菌株YX7 特异性条带、共同条带）情况分别标记为：○●●、●●●和●○○。将同一杂交菌株不同引物的结果进行综合分析，同一类型条带只要有一个引物的结果为●，则该类型条带综合结果标记为●，若所有引物的结果均为○，则该杂交菌株该类型条带综合结果标记为○。

2 结果与分析

2.1 双单杂交子的镜检和拮抗测试

随机挑取40 个杂交菌株进行显微检测和与2个亲本菌株的拮抗测试（表2）。显微检测结果表明，40 个杂交菌株中共有36 个菌株检测出锁状联合结构，这些菌株可鉴定为双核菌株，剩余4个杂交菌株未检测出锁状联合结构，其可能是单核菌株，初步鉴定为非杂合子。拮抗测试结果表明，与2 个亲本菌株的拮抗反应均明显的杂交菌株共有19 个，可初步鉴定为杂合子。对2 个亲本菌株均有拮抗反应，但拮抗反应不明显的杂交菌株共有5 个；与亲本无拮抗反应的杂交菌株共有16 个。不明显的拮抗反应与无拮抗反应二者较难区分，如菌株808 自身应无拮抗的菌落间也有不明显的沟痕，菌株YX7 自身应无拮抗的菌落间也有细微隆起（图2）。因此，菌株15 与YX7 的菌落间有不明显的沟痕，本研究判断为不拮抗，菌株47 与808 菌落间有不明显隆起而判断为轻微拮抗，菌株24 与YX7、菌株49 与808 菌落间明显隆起而判断为明显拮抗。可见，拮抗反应的判断具有主观性，存在误判的可能。19 个与亲本均拮抗明显的杂交菌株同时检测出锁状结构，可确定为杂合子，分别是菌株2、3、7、8、9、13、23、24、31、34、35m、38、39、42、46、52、57、66 和67。与亲本拮抗不明显的5 个杂交菌株中，菌株1、52e 和68 检测有锁状结构，菌株47 和79 未检测出锁状结构。与亲本不拮抗的16 个杂交菌株中，菌株15、36m、36e、37m、37e、49、52m、58m、58 e、60、70、70e、74 和78 共14个菌株存在锁状结构，菌株56m 和73 未检测出锁状联合结构。

2.2 传统ISSR 多引物综合分析双单杂交菌株

采用P1、P2、P4 和P9 引物的ISSR 數据对选用的40 个香菇杂交子菌株进行综合分析（表3）。40 个杂交菌株中，27 个杂交菌株2、3、7、8、9、13、23、24、31、34、35m、37m、37e、38、39、42、46、47、52、52e、57、58e、66、67、70、70e 和79 均具有两亲本的特异性条带，确定为杂合子；13 个杂交菌株1、15、36m、36e、52m、49、56m、58m、60、68、73、74 和78 仅有单个亲本菌株的特异性条带，不能确定为真正的杂合子，但它们均具有两亲本的共同条带，由于共同条带无法确定源自哪个亲本，因此也不能排除它们为杂合子的可能性。

2.3 新型ISSR 技术单引物鉴别分析双单杂交菌株

新型ISSR 技术采用筛选出的单个引物P1，该引物能扩增出供体菌株YX7 的d、e 和f 3 条特异性条带（图3），其中f 条带在所有杂交菌株中均有出现，而d 和e 条带则分别出现在不同的杂交菌株中。说明f 条带位点同时分布在供体亲本菌株YX7 的2 个细胞核中，而d 和e 条带位点则分别分布在菌株YX7 的2 个细胞核中。因此，根据电泳图谱可将待测菌株分成4 类，第1 类为拥有d 特异性条带的杂合子（图3 中的菌株2、3、13、23 和31），第2 类为拥有e 特异性条带的杂合子（图3 中的菌株7、24、34、39 和42），第3类为同时拥有d 和e 条带的非杂合子（图3 中的菌株1、49 和52m），第4 类为d 和e 条带都没有的非杂合子（图3 中菌株56m）。第3 类非杂合子可能是误挑取的供体亲本菌株YX7 本身，第4 类非杂合子则是未获得供体核的808 孢子单核体。

研究结果表明，40 个待测菌株中共有27 个为杂合子，其中拥有d 条带的杂合子为菌株2、3、9、13、23、31、35m、37m、37e、38、46、52e、57、58e、66、67、70、70e 和79，拥有e 条带的杂合子为菌株7、8、24、34、39、42、47、和52。11 个菌株1、15、36m、36e、49、52m、58m、60、68、74 和78 为误挑取的供体亲本YX7 双核菌株；菌株56m 和73 则为未杂交成功的808 孢子单核体菌株。

3 讨论

菌丝存在锁状联合和与两亲本存在拮抗反应，是鉴别异宗结合食用菌如姬菇[15]、杏鲍菇[16]、金针菇[17]、香菇[6]等品种杂交后代的最常用方法。本研究中，40 个杂交菌株中有19 个菌株同时与两亲本具有明显的拮抗反应并具有锁状联合，可以确定是杂合子。但也有存在锁状联合结构而与亲本拮抗反应不明显或无拮抗反应的情况，如菌株1、52e、68、15、36m、36e、37m、37e、49、52m、58m、58e、60、70、70e、74、78 等。由于挑取双单杂交后代时有可能取到双核亲本的菌丝，它们具有锁状联合结构，而自身又存在轻微拮抗反应，此时很容易将这些非杂合子误判为杂合子，所以有锁状联合但与亲本存在不拮抗或拮抗不明显的菌株还有待进一步的检测确定。菌株47 和79 未检测出锁状联合，但与两亲本均有轻微拮抗反应，这也有待于进一步检测，以免因锁状联合未被发现导致将杂合子误判为非杂合子。可见，传统的锁状联合和拮抗反应观测结果只能确定部分杂合子，尚有许多不能确定的菌株，而且容易产生误判。

为确保杂合子鉴别的准确性和高效率，分子标记技术被越来越多应用于杂交子的鉴定。王丽宁等[10]和宋春艳等[18]分别采用传统ISSR 和RAPD 分子标记技术比较香菇杂交子与亲本间的遗传差异，但由于孢子与亲本本身存在遗传差异，不能根据杂交子与亲本存在遗传差异而判断其为杂合子。陈世通等[12]通过筛选出ISSR 引物6，将香菇单单杂交菌株中同时拥有2 个亲本的特异性条带的菌株成功判断为杂合子。但传统ISSR 技术需要多个引物进行分析比较才能辨识出尽可能多的杂合子，而仅凭单个或少数引物的结果则有可能使部分杂合子不被辨识。本研究采用多个引物对香菇双单杂交菌株进行传统ISSR 分析，根据杂交菌株是否拥有两亲本特异性条带判断其是否为杂合子，结果发现，部分菌株（如菌株8）单个引物（如P1、P2 或P9）的ISSR 图谱仅有一个亲本的特异性条带，不能被标识为杂合子，但综合多个引物的结果则同时拥有两亲本特异性条带，可判断为杂合子。可见，增加引物数量可提高传统ISSR 技术对杂合子的辨识率。本研究采用4个引物对待检杂交菌株进行传统ISSR 分析，结果从40 个杂交菌株中共辨识出27 个杂合子菌株，仍有13 个菌株尚无法判断是杂合子还是非杂合子。可见，传统ISSR 技术判断出的杂合子具有较高的准确性，但无法判断非杂合子菌株。

双单杂交的供体是双核菌株，其2 个核的基因型是固定的，杂交时单核体只能接受其中一个核形成新的杂合子，不同杂合子接受到的核只有2 种，它们受单核体基因型的控制[3]。因此，可通过标记区分供体2 个细胞核，对杂合子进行鉴定。本研究构建了一种新型ISSR 分子标记技术鉴别香菇双单杂交杂合子，该技术利用单个引物（P1）可扩增出双单杂交中供体亲本菌株的2 个细胞核的特异性条带，拥有其中任意一条特异性条带的杂交菌株可判断为杂合子，无特异性条带或同时拥有2 个细胞核的特异性条带的杂交菌株均可判断为非杂合子。本研究结果表明，新型ISSR 分子技术从40 个杂交菌株中检测出27 个菌株为杂合子，检测出的杂合子菌株与传统ISSR 方法检测的结果完全一致，同时确定其余13 个菌株为非杂合子。27 个杂合子中，有19 个杂合子接受了供体相同的一个细胞核，另外8 个杂合子则接受了供体的另外一个细胞核，从而可将杂合子分为2 类，有利于后续的农艺性状定位和遗传分析。

与传统显微观察与拮抗试验方法相比，新型ISSR 技术可鉴定出待检菌株中的全部27 个杂合子菌株，而传统显微观测与拮抗试验方法只能确定19 个菌株为杂合子；传统方法容易将有锁状联合但无拮抗或拮抗不明显的菌株（如菌株52e、37m、37e、58e、70 和70e），以及未检测出锁状联合的菌株（如菌株47 和79）误判为非杂合子，而新型ISSR 技术可准确鉴定它们为杂合子，菌株47 和79 未检测出锁状联合可能是显微检测时视野数量不够多所致；传统方法有时也容易将非杂合子误判为杂合子，如菌株1 与808 有明显拮抗，与YX7 有轻微拮抗，且菌丝有锁状联合，按传统方法判断应为杂合子，但新型ISSR 技术结果表明，菌株1 同时具有供体2 个核的特异性条带，为YX7 自身而非杂合子。可见，新型ISSR 分子技术可以完美解决传统显微观察和拮抗试验对杂合子鉴别结果不够全面和容易产生误判的问题。

与传统ISSR 技术相比，新型ISSR 技术采用单个引物就可确定全部27 个杂合子菌株，而传统ISSR 技术需采用4 个引物才能鉴别出27 个杂合子。新型ISSR 技术可确定剩余13 个菌株为非杂合子，其中有11 个菌株（分别为1、15、36m、36e、49、52m、58m、60、68、74 和78）同时拥有供体亲本2 个核的特异性条带，说明它们是供体菌株YX7 本身，可能是挑取菌丝时误取到供体菌丝所致；另外2 个非杂合子菌株56m 和73 不拥有供体任一核的特异性条带，说明是受体菌株808 的孢子单核体。而传统ISSR 技术则无法确定剩余13 个菌株为杂合子还是非杂合子，更无法解释非杂合子的来源。新型ISSR 技术能根据导入的供体细胞核类别将杂合子归为2 类，而传统ISSR则不能对杂合子进行分类。

综上所述，基于供体亲本菌株双核特异性条带的单引物新型ISSR 分子标记技术可准确鉴别待测菌株是杂合子还是非杂合子，解决了传统显微观察和拮抗试验方法效率低、准确性差的问题，同时解决了传统ISSR 技术需要采用多引物而程序复杂、杂合子鉴别结果全面性不确定、无法判定非杂合子、不能对杂合子归类的问题，是一种简便、快速和有效的香菇双单杂交后代鉴定技术。该技术不仅可运用在香菇杂交育种中，还可拓展到其他食用菌品种的杂交育种中，缺点是不能用于单单杂交中的杂合子鉴别。