防脱发中药复方提取物生物活性分析

乐纯琰　高天问　杨国蓉　贾鑫茹　丁滨　黄杰

【摘要】  目的  探究一个中药复方提取物（至墨植萃粉，ZMD）防脱发，促进毛发生长的生物学机理。方法  采用UPLC-MS/MS表征复方中的主要成分，采用网络药理学方法预测ZMD的生物活性；分别用CCK-8试剂盒和BODIPY染色测定细胞增殖活性，并观察脂滴形态；通过荧光定量PCR检测基因转录表达。结果  质谱表征得到了60多个化合物，网络药理学预测这些化合物可能通过Wnt/β-catenin信号通路影响毛囊周期；ZMD的乙酸乙酯部位（Peap）能够促进HaCaT细胞的增殖、缓解细胞氧化应激反应、防止脂质蓄积，能上调Wnt10b、Wnt10a、β-catenin和AKT的转录。结论  洗发水中药复方提取物中的乙酸乙酯部位是可以通过AKT途径促进细胞增殖活性，并可以通过p-AKT和Wnt10激活β-catenin的表达，进而延长毛囊生长期，达到防脱发的目的。

【关键词】  UPLC-MS/MS；网络药理学；生物活性；Wnt/β-catenin 信号通路；AKT

中图分类号  R285    文献标识码  A    文章编号  1671-0223（2023）01--04

最新调查数据显示，中国目前有2.5亿脱发人群，平均每6个中国人中就有1个饱受脱发困扰，且26～30岁是脱发的“高发”年龄段[1]，占比高达84%，较上一代人的脱发年龄提前了20年。脱发的低龄化趋势推动了相关临床防治和病理基础的研究。脱发分为生理性和病理性两类，生理性脱发是毛囊进入休止期后正常的脫落现象，每天有100～150根毛发脱落则属于毛囊生理周期的自然结果[2]；病理性脱发则是临床上的一种皮肤疾病。临床上常见的脱发类型有雄激素性脱发[3]、斑秃[4]、瘢痕性脱发[5]、药物性脱发[6]、头癣[7]、营养不良脱发[8]等。由于病症的严重程度及治疗成本的差异，多数轻症患者会选择防脱发洗发水进行治疗。2019年7月，《消费者报道》从京东、天猫两个电商平台收集了8款防脱洗发水的3.2万条消费者评论数据，从消费者评论数据来看，目前市场上洗发水在防脱效果上表现一般[9]。近年来，随着防脱洗发水需求的快速增长和一二线城市洗发水市场规模的迅速扩大，以中药成分为主打的防脱发洗发水已占据了洗护市场28%的份额[10]。

国医大师禤国维教授以中医药治疗雄激素性脱发颇具特色，强调肝肾不足为其发病之根本[11]，用加味二至丸平补肝肾治其本，凉血清热治其标[12]，疗效显著。本项目中的洗发水中药复方就是在古方“二至丸”的基础上添加首乌、桑葚、红花等十几味中药材而制成。通过前期的试用反馈，有26.3%的受试者认为该洗发水能够缓解脱发。中药复方提取物化合物成分复杂，作用靶点多，为科学地阐述该中药复方防脱发的生物学机制，本研究对该洗发水中药复方提取物的化合物组分、生物活性部位进行初步探究。

1  材料与方法

1.1  材料和试剂

HaCaT细胞购自国家实验细胞资源共享平台；中药复方提取物（至墨植萃粉，ZMD）由杭州至墨生物科技有限公司提供；其他生化及化学试剂、培养基、特异性抗体等分别购自北京标谱检测科技有限公司、德国Merck公司、杭州高晟生物科技有限公司、赛默飞世尔科技公司和武汉博欧特生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2  仪器与设备

本研究用到以下设备：细胞培养箱（宁波海曙赛福实验仪器厂）；全波长分光光度计（英国柏楉有限公司）；旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；Waters ACQUITY I-Class Plus UPLC超高效液相色谱系统（美国沃特斯公司）；SCIEX X-500R四极杆飞行时间质谱（美国AB SCIEX 公司）；实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔科技公司）。

1.3  实验方法

1.3.1  中药复方制备及化学成分分析

采用200ml 45%乙醇溶解25g ZMD，依次加入等体积的石油醚、乙酸乙酯（去除乙醇后）、水饱和正丁醇溶液进行分级萃取，将分离得到的各萃取部位用旋转蒸发仪旋干备用。配制浓度为1mg/ml的中药复方供试品溶液。设置色谱条件：流动相0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脱程序：0～2.7min，99% B；2.7～8 min，99%～68% B；8～28min，68%～45% B；流速：0.3 ml/min；进样盘温度：8℃；柱温：40℃；进样量：3μL。设置质谱条件：飞行质谱ESI正负粒子扫描模式，进样分析。根据化合物的一级精确质量数、同位素分布比和MS/MS搜索SCIEX OS配置的中药二级数据库TCM MS/MS Library（包含1000多种中药化合物二级数据），完成对目标物的筛查。

1.3.2  细胞模型的建立和指标检测

将细胞按1×104 个/孔接种到96孔板中，加入含有10%小牛血清的MEM培养基培养过夜，分别用800μMH2O2、400μM油酸（OA）处理细胞构建抗氧化和脂质蓄积模型，用梯度浓度制备的复方各个部位处理不同模型，用CCK-8试剂盒检测细胞活性、BODIPY染料进行细胞染色。

1.3.3  网络药理学分析

利用TCMSP数据库（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）筛选中药的有效成分及相应靶基因，构建靶基因数据库；借助Gene Cards数据库（https：//www.genecards.org/）寻找疾病基因；借助Venny 2.1.0平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）获得中药复方活性成分与疾病的交集基因及韦恩图；利用 Cytoscape3.8.2 软件构建成化合物-关键靶点-疾病网络图并进行分析。

1.3.4  实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测相关基因表达

收集细胞，PBS洗3次后用Trizol法提取细胞总RNA，测定RNA浓度并逆转录为cDNA。在八联管中依次加入cDNA，双蒸水，特异性引物和2X SYBR Green Mix，离心后放入荧光定量PCR仪，反应条件：预变性：94℃，5min；变性：94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，44个循环；延伸：72℃，5min。

1.3.5  统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0软件对所得数据进行分析处理。数据以均数±标准差表示，数据间采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  复方活性部位的细胞模型评价

分别用浓度为10～100μg/ml的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇和水溶部位处理细胞发现乙酸乙酯部位（Peap）和正丁醇部位（Pwnp）有促进细胞增殖的活性（见图1 A、B，阴性结果未展示）。在氧化应激模型中，浓度为40、60、80μg/ml的Peap有显著的缓解细胞氧化应激反应的活性（P<0.01）（见图1 C），而Pwnp未出现保护效果（见图1 D）。在脂质蓄积实验中，与Ctrl组比较OA处理后造成的脂质蓄积明显，Peap处理不会造成脂质蓄积，而且能够显著清除OA模型细胞中脂质蓄积（见图2）。

2.2  网络药理学预测

通过UPLC-MS对中药复方Peap部位进行初步表征分析后，得到正离子模式下中药复方归属的化学成分31个，负离子模式下中药复方归属的化学成分38个。对表征的化合物进行网络药理分析共获得207个中药复方潜在靶点，与652个脱发相关的疾病靶点对比，获得34个中药复方—疾病交集基因（见图3）。将此34个共同靶点和中药复方潜在靶点输入Cytoscape 3.8.2软件中绘制出“化合物-关键靶点-疾病”相互作用网络图，图中红色代表疾病，蓝色代表化合物，黄色代表34个共同靶点（见图4）。将得到的34个交集基因借助STRING数据库分别进行GO和KEGG分析，分别得到GO条目752个（P<0.05）和75条信号通路，其中Wnt/β-catenin信号通路高度聚焦。

2.3  RT-PCR检测毛囊发育和细胞增殖相关基因的转录表达

与Ctrl组相比，Peap（40、60μg/ml）处理极显著上调了细胞中Wnt10b、Wnt10a、β-catenin、AKT的转录表达，且低浓度效果较高浓度更明显（见图5）。

3  讨论

本研究中涉及的中药复方提取物是一款防脱发洗发水中添加的主要活性成分，该复方由古方“二至丸”加味制成，目前尚未有对其防脱发的生物学机制的研究。经过液质联用表征和网络药理学分析，我们推测弱极性部位可能是该复方提取物的主要活性部位，而作用靶点集中在诱导细胞分化的Wnt/β-catenin通路。我们用不同极性的溶剂将其进行逐级萃取分离，得到了石油醚、乙酸乙酯（Peap）、水饱和正丁醇（Pwnp）和水相四个部位，细胞活性实验结果发现Peap和Pwnp两个部位有促进细胞增殖的活性，而在氧化应激实验中仅Peap（40～80 μg/ml）表现出显著的抗氧化活性，因此在脂质蓄积实验中我们仅对该部位的活性进行了研究，发现80μg/ml的Peap能够显著清除细胞中的脂质蓄积。通过上述研究我们推测Peap的活性浓度在40～80μg/ml范围内。在接下来的研究中我们用RT-PCR方法证明了该浓度范围Peap能调控Wnt/β-catenin通路。

大量研究证明，驱动毛囊干细胞从静止期进入生长期可以有效防止脱发，而Wnt/β-catenin途径参与了该过程[13]，其中p-AKT促进β-catenin的表达，从而使Wnt10a、Wnt10b的表达激增，进而延长毛囊生长期[14]，而我们通过网络药理学的分析也预测到Wnt/β-catenin可能是Peap的作用靶点之一，研究发现用Peap处理细胞促进了Wnt10a、Wnt10b和β-catenin表达，说明Peap可能同时通过Wnt10和AKT两个信号通路叠加促进了β-catenin的表达。我们推测这与Peap中复杂的化学成分有关。因为AKT是通过传递磷酸化信号发挥调控功能的，因此这并不影响细胞增殖活性[15]。

中医认为毛发的不正常脱落是体内脏腑经络气血的活动失调所致[16-17]。肾主骨，生髓充脑，其华在发，发的生长，赖血以养，故称“发为血之余”[17]。当代年轻人生活节奏快，工作压力大，脱发病因多以肝肾阴虚为根本，加之不规律的饮食及生活习惯导致[17]。二至丸出自《扶寿精方》，由等质量的女贞子和旱莲草组合而成，女贞子采于冬至，而旱莲草采于夏至，故名为二至丸[18]，具有补肝肾之阴的作用，在临床上被广泛用于肝肾阴虚所致的口苦咽干、失眠健忘、多梦易醒、头昏头痛、腰膝酸软、月经不调、须发早白等症[19]。有文献报道，近年来二至丸（或加味二至丸）为临床上治疗脱发使用频率较高的方剂[20]，且收效良好。但目前尚未有相关作用机制的研究，而我们的研究仅仅是对加味二至丸防治脱发的生物学机制的初步探索。

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[2022-04-08收稿]