霜降前后白茶主要化学成分及生物活性分析

宋大鹏 王梦琪 李纪艳 尹洪旭 常学霞 王鲲鹏 丁仕波

摘要：采用山东省日照市黄山群体种茶树霜降前后一芽二叶鲜叶原料，按照白茶加工工艺制备白茶样品，研究分析了霜降前后白茶样品主要化学成分的差异以及体外生物活性情况。化学成分分析表明，“霜前”“霜后”白茶样品的水浸出物含量、可溶性碳水化合物含量、茶多酚含量、总黄酮含量以及儿茶素含量等存在明显差异；广靶代谢组学分析表明，“霜前”“霜后”两组白茶样品中存在差异化合物有10 大类99 种，主要包括脂质（16 种）、糖及醇类（15 种）、黄酮类（13 种）、生物碱类（12种）、氨基酸及其衍生物（12 种）、核苷酸及其衍生物（9 种）、有机酸类（8 种）、酚酸类（7 种）、木脂素和香豆素（4 种），以及鞣质（3 种）；相较于“霜前”白茶，“霜后”白茶中有49 種差异化合物呈上调趋势、46 种差异化合物呈下调趋势；活性分析结果表明，“霜前”白茶样品的体外抗氧化活性和抑制α-淀粉酶活性显著高于“霜后”白茶样品，“霜后”白茶样品的胆酸盐结合活性高于“霜前”白茶样品；两种白茶样品对NO抑制率水平无显著性差异。

关键词：霜胁迫；白茶；化学成分；生物活性

中图分类号：TS272.5   文献标识码：A   文章编号：1000－3150 （2023） 05-42-11

山东省日照市位于北纬35°04′—36°04′，是山东茶区最大的优质绿茶生产基地，对茶树生长而言，具有纬度高、昼夜温差大以及低温逆境胁迫等环境特点。日照茶区一般在“霜降”节气前后，昼夜温差尤为明显，这对茶树的生长代谢产生了重要影响。有研究表明，在“霜降”前后的一段时间内，茶、水果的生化成分可能有较大的变化，另外“霜处理”对一些饮料植物的风味品质以及内质成分具有重要影响。例如，比较不同采收时期北国蓝葡萄酒香气成分时，发现霜降后采摘的果实中香气成分种类及含量均有所增加，包含总酚、还原糖等在内的物质含量也同样升高[1]。值得关注的是，在茶叶加工领域，乌龙茶产区存在冬茶（也称冬片、雪片） 的制作传统[2]，于霜降后采制的冬片，多糖含量高，酯型儿茶素含量较低，因而茶汤甜味足、苦涩味低[3]。

日照茶区以生产春、夏、秋三季绿茶为主，霜降前停止生产，茶农为茶树进入冬季休眠准备越冬防护。采用设施防护越冬的茶园，一般在扣棚前修剪茶树；自然越冬的茶园，在翌年春分节气前后修剪茶树。修剪后的枝条作为农业废弃物处理，这在一定程度上造成了茶叶资源的浪费。因此，有效利用当地的茶叶资源，研究开发一些霜降后茶产品，有助于提高日照茶区茶叶资源的利用率，拓宽市场和助农增收。白茶制作工艺主要包括萎凋、干燥两个步骤[4]，初霜后的茶树鲜叶有萎蔫失水特征，适合制作白茶。有研究表明，白茶具有抗氧化、抗突变、降血糖血脂、抗菌消炎等诸多保健功效[5-9]，受到消费者青睐，市场发展势头强劲。

因此，为更好利用日照茶区霜降后茶叶资源，开发当地茶叶新产品，本研究采用霜降后的一芽二叶鲜叶原料，按照白茶的加工工艺制备白茶样品，对照霜降前采制的白茶，分析其主要化学成分、体外生物活性之间的差异。研究结果将有助于开发新的白茶产品，为日照茶区生产“霜后”白茶提供科学依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂白茶材料：日照市马陵春茶叶有限公司黄山群体种茶树鲜叶，鲜叶分别于2019 年、2021 年霜降前1 周（霜前）、降霜后1周（霜后） 采摘，采摘标准为一芽二叶。按照萎凋（室温，72 h） →干燥（90 ℃至足干） 的工艺流程加工制作成白茶样品，样品代号见表1。样品在室温下密封避光保存。

试剂：甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），德国Merck 公司；乙酸（色谱纯）、儿茶素类化合物标准品、2，4，6-三（2-吡啶基） 三嗪、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二铵盐（ABTS）、α-淀粉酶，美国Sigma 公司；DNS试剂，北京索莱宝公司；可溶性淀粉，上海麦克林公司；胆酸钠、牛黄胆酸钠、甘氨胆酸钠，上海阿拉丁公司；氯化硝基四氮唑蓝、核黄素，国药集团化学试剂有限公司；甲硫氨酸、乙二胺四乙酸二钠、抗坏血酸等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AB107- S 电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司），超高效液相色谱和串联质谱（UPLC-MS/MS，日本岛津公司），Agilent SB-C18 色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美国安捷伦公司），Synergy H1酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）， Centrifuge5810 R离心机（德国Eppendorf 公司）。

1.3 感官审评方法

由6 名具有高级评茶员及以上资质的工作人员（3 名男性、3 名女性） 组成审评小组，参照《茶叶感官审评方法》（GB/T 23776—2018），主要侧重对茶样的滋味品质进行感官审评。

1.4 茶汤中主要品质成分检测方法

水浸出物含量按照《茶水浸出物测定》（GB/T 8315—2013） 中的方法进行检测；茶多酚及儿茶素类含量按照《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》（GB/T 8313—2018） 进行检测；儿茶素组分的检测参考Yang 等[10]的方法进行；总黄酮含量参照三氯化铝比色法测定；水溶性碳水化合物含量测定采用蒽酮比色法进行。

广靶代谢组学分析委托武汉迈维公司进行分析检测。茶样真空冷冻干燥后研磨至粉末状。取100 mg茶粉溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中涡旋，样本置于4 ℃冰箱过夜；离心后吸取上清液，用微孔滤膜（0.22 μm） 过滤，待UPLC-MS/MS分析。

色谱条件： Agilent SB-C18 色谱柱， 流速0.35 mL/min；柱温40 ℃，进样量4 μL；流动相A相为超纯水（溶有0.1%甲酸），B相为乙腈（溶有0.1%甲酸）；流动相梯度洗脱条件：0 min，5% B相；9 min，95% B相；10 min，95% B相；11 min，5% B相；14 min，5% B相。

质谱条件：ESI 源温度550 ℃，离子喷雾电压（IS） 5 500V/－4 500V；离子源气体Ⅰ （GSⅠ），气体Ⅱ （GSⅡ） 和帘气（CUR） 分别设置为50、60、25.0 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在QQQ和LIT 模式下分别用10、100 μmol/L 聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ 扫描使用MRM模式，并将碰撞气体（氮气） 设置为中等。

1.5 体外生物活性评价方法

胆酸钠盐结合活性参考李珊等[11]的方法进行检测，茶样稀释成不同质量浓度进行最适范围筛选，最终选取最适质量浓度1.4 mg/mL，此时胆酸钠结合率接近50%，易于进行结果观测。NO抑制活性分析，取0.1 g茶粉加5 mL沸水浸提5 min，稀釋40倍，然后参照李明超等[12]的方法进行检测。α-淀粉酶抑制作用分析取0.1 g茶粉加入10 mL水，沸水浸提10 min，4 000 r/min 离心10 min 后参照Li 等[13]的方法进行检测。体外抗氧化活性参照吕海鹏等[4]的方法进行，主要测定清除DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基活性，以及铁离子还原能力法（FRAP） 测定总抗氧化活性等。

1.6 数据处理

显著性差异分析采用SPSS18.0 数据处理软件；主成分分析（PCA） 和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA） 等采用R 软件；热图绘制采用Origin21.0、Heml等数据处理软件。

广靶代谢组学数据处理基于数据库MWDB，根据二级谱信息进行物质定性。代谢物定量利用三重四级杆质谱的多反应监测模式分析完成。获得样本的代谢物质谱分析数据后，对所有代谢物质谱峰进行峰面积积分并校正[14]，校正工作由仪器自动根据调谐液（AB Sciex 配备） 中的标准离子进行质量轴的校准。

2 结果与分析

2.1 霜降前后白茶样品感官分析结果

“霜前”“霜后”白茶的感官审评结果见表2，“霜前”干茶墨绿，“霜后”干茶黄绿、有蜡片；“霜前”茶汤橙黄尚亮，“霜后”茶汤浅黄明亮；“霜前”茶汤滋味呈现尚醇、尚浓醇、有涩感的品质特点，“霜后”茶汤滋味呈现清甜、回甘、柔和的品质特点；“霜前”“霜后”白茶香气皆纯正，2021年霜后白茶略带青气。

2.2 霜降前后白茶样品主要化学成分分析结果2

.2.1 茶多酚、总黄酮含量分析

经化学成分分析（表3），两组白茶中茶多酚含量均为“霜前”高于“霜后”，其中2021 年“霜前”“霜后”白茶的茶多酚含量差异显著。有研究表明，茶树中茶多酚的合成代谢与日照、温度有关，低温和弱光条件下，茶树中合成碳素化合物减少[15]，茶多酚作为碳素代谢二级产物，其合成积累也会随之减少，推测霜低温胁迫导致“霜后”白茶中茶多酚含量降低。

2021 年“霜前”白茶的总黄酮含量显著高于“霜后”白茶，2019 年“霜前”“霜后”无显著差异。黄酮类物质是茶多酚的组成成分之一，因此这类物质在合成积累过程中受光照与温度的影响可能与茶多酚变化一致。

2.2.2 水浸出物含量分析

水浸出物的主要成分为茶多酚、氨基酸、咖啡碱、水溶性果胶、可溶性糖等带有风味的物质，其含量可在一定程度上反映茶叶品质好坏[16]。2021 年“霜前”“霜后”白茶的水浸出物含量之间不存在显著性差异；2019 年“霜后”白茶的水浸出物含量极显著高于“霜前”白茶。

2.2.3 可溶性碳水化合物含量分析

茶叶中的可溶性碳水化合物主要是指水溶性糖，化学成分分析表明，“霜后”白茶可溶性碳水化合物含量丰富，与“霜前”白茶有极显著差异。这与有关茶树抗寒生理指标研究结论相似[17]，低温环境能够促使茶树体内淀粉水解为可溶性糖，提高细胞渗透势[18-19]；同时可溶性糖还可与细胞膜上成分结合，保护光合系统[20]。因此，可以推测低温霜胁迫条件是导致“霜后”白茶中可溶性碳水化合物含量升高的主要原因。此外，可溶性糖对茶汤的甜味具有非常重要的贡献作用，这与感官审评中“霜后”白茶滋味甜醇、回甘结果一致。

2.2.4 儿茶素类物质含量分析

分析几种重要儿茶素类物质结果表明（表4），苦涩味较小的非酯型儿茶素中，没食子儿茶素（GC） 含量在2019 年、2021 年“霜后”茶样中均显著上升；表儿茶素（EC） 含量在2019 年霜降前后茶样间差异不显著，2021 年在“霜后”茶样中极显著上升。“霜后”茶样中苦涩味较大的几种酯型儿茶素， 即表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、儿茶素没食子酸酯（CG） 的含量均低于“霜前”茶样，这与袁祯清等[3]的研究结论一致；没食子酸（GA） 作为酯型儿茶素的合成前体物质，其在白茶样品中的含量同上述几种酯型儿茶素一致，呈现“霜前”茶样高于“霜后”茶样的规律。推测“霜后”茶样中酯型儿茶素的合成代谢因前体物质GA含量下降而减弱，亦或在低温条件下转化形成其他物质，导致茶叶中的酯型儿茶素含量下降，有关酯型儿茶素在低温霜胁迫条件下的详细代谢过程有待深入分析。酯型儿茶素是茶汤涩味的主要贡献成分，其含量占比的减少，在一定程度上降低了涩感，使茶汤滋味更柔和[21]。这与感官审评中“霜前”白茶滋味有涩感、“霜后”白茶滋味柔和结果一致。

2.3 霜降前后白茶样品广靶代谢组学分析结果

由图1 可知，质控样本的总离子流图重叠性较高，表明本试验的检测方法信号稳定、数据可靠。对包括质控样本在内的样本进行PCA 和OPLS-DA 分析。前5 个主成分累计贡献率为88.74% （表5）， 表明样本组间分离趋势明显，PCA 结果可靠，能够反映样品间生物学差异。由表6 可知，两组白茶样品的OPLS-DA模型的Q2均大于0.9，R2X 分别为0.81 和0.74，说明样品间存在显著差异，OPLS-DA模型稳定，预测性较有意义。对两组白茶的差异化合物进行韦恩图分析（图2），试验鉴定得到“霜前”“霜后”两组白茶样品共同差异化合物有10 大类99 种，主要包括脂质（16 种）、糖及醇类（15 种）、黄酮类（13 种）、生物碱类（12 种）、氨基酸及其衍生物（12 种）、核苷酸及其衍生物（9 种）、有机酸类（8 种）、酚酸类（7 种）、木脂素和香豆素（4种），以及鞣质（3 种），对比“霜前”白茶，“霜后”白茶中有49 种呈上调趋势、46 种呈下调趋势（表7）。

2.3.1 脂2.3.1 脂质、糖及醇类差异化合物

脂质差异化合物共16 种，以1，14-十四烷二酸、十六烷基二酸等为代表的15 种脂质在“霜后”白茶中上调。脂质是茶叶风味形成的前体物质之一，部分脂质可通过亚油酸、α-亚麻酸代谢通路形成香气物质[22]；脂质还可参与植物角质层的形成，在极端温度、干旱等逆境胁迫条件下起到屏障保护作用[23]。广靶代谢组学结果表明，十六烷基二酸含量在“霜后”白茶中上调，参与茶叶中角质、苏氨酸和蜡的生物合成。感官审评“霜后”白茶中有明显蜡片，也证明为抵御霜低温胁迫，有关脂质代谢加快，促进了茶树叶片角质层形成。

以D-蔗糖、D-海藻糖以及麦芽糖醇等为代表的糖及醇类差异化合物共15 种，它们的含量在“霜后”白茶中上调。KEGG代谢通路显示，D-蔗糖、蜜二糖、D-海藻糖以及水苏糖等是半乳糖、淀粉和蔗糖代谢的中间或最终产物；这些糖类物质也是茶叶中可溶性碳水化合物的重要组成成分。推测霜低温条件促进了茶树鲜叶内半乳糖、淀粉降解转化生成D-蔗糖、蜜二糖、D-海藻糖等小分子可溶性糖，使得“霜后”白茶中可溶性碳水化合物含量得到显著提高。

2.3.2 黄酮类、生物碱类差异化合物

黄酮类物质在茶叶中含量丰富，且具有良好的保健功效[24-25]。由表7 可知，13 种黄酮类差异化合物大部分为黄酮苷类，其中以二氢山奈酚、槲皮素-3-O-芸香糖苷、圣草次苷等为代表的6 种黄酮类物质含量在“霜后”白茶中下调；以2-羟基柚皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷等為代表的7 种黄酮类物质含量在“霜后”白茶中上调。有研究表明，槲皮素-3-O-葡萄糖苷是一种黄酮单体化合物，在多种天然植物中均有广泛存在，具有治疗心肌缺血、缺氧的生理活性[26-27]。

可可碱、2-苯乙胺等9 种生物碱含量在“霜后”白茶中下调；N，N-二甲基-5-甲氧基色胺等3 种生物碱含量在“霜后”白茶中上调。广靶代谢组学表明苯丙氨酸是2-苯乙胺的合成前体，苯丙氨酸的生物代谢通路显示其含量下调，推测苯丙氨酸含量下降是造成2-苯乙胺呈下调趋势的主要原因。

2.3.3 氨基酸及其衍生物、其他类差异化合物

氨基酸类物质不仅影响茶叶的风味，还能帮助茶树抵御环境胁迫[28]。本试验中，以L-缬氨酸、L-天冬氨酸以及L-苯丙氨酸为代表的11 种差异氨基酸及其衍生物含量均呈下调趋势，以往有关低温与茶树渗透调节物质的研究中也有相似结论，即茶树在历经低温后氨基酸含量下降[29]，推测样品白茶中差异氨基酸的含量降低，可能与霜低温胁迫导致差异氨基酸合成相关酶活性下降有关。

“霜前”“霜后”白茶样品中还存在一些核苷酸及其衍生物类、有机酸类、酚酸类、木脂素和香豆素以及鞣质等差异化合物。其中，以3-甲基黄嘌呤、胞嘧啶为代表的核苷酸及其衍生物类差异化合物共9 种，均呈下调趋势；有机酸类差异化合物共8 种，以琥珀酸为代表的5 种有机酸含量上调，以2-吡啶甲酸为代表的3 种有机酸含量下调；酚酸类差异化合物共7 种，以苯甲酰胺为代表的4种酚酸含量下调，脱氢二松柏醇-γ'-O-葡萄糖苷含量上调，其他2 种无明显变化规律；木脂素和香豆素类差异化合物3 种上调，1 种下调；鞣质类差异化合物共3种，均呈下调趋势（表7）。

2.4 霜降前后白茶样品生物活性分析

有研究表明，白茶在降血糖、降血脂以及抗氧化和抗菌消炎等方面效果显著[5]，为探究“霜后”白茶的保健功效，本研究采用体验试验方法对其胆酸盐结合活性，α-淀粉酶、NO抑制活性以及抗氧化活性能力进行分析。

2.4.1 胆酸盐结合活性分析

胆酸盐是生物体肝肠循环的重要物质，食品中存在的一些组分能够通过结合胆酸盐的方法阻止胆酸盐的重吸收，进而降低血浆中胆固醇含量、降血脂[30-31]。本研究选取了3 种具有代表性的胆酸钠结合方法，研究分析不同白茶样品对胆酸盐的影响。由图3 可见，“霜后”白茶样品的牛磺胆酸钠结合率极显著高于“霜前”白茶；胆酸钠结合率也同样呈现“霜后”白茶高于“霜前”白茶，但不存在显著差异；“霜后”白茶样品与甘氨胆酸钠结合率同样高于“霜前”白茶，并在2021年的样品中呈现出显著差异。说明在体外试验中“霜后”白茶样品低胆固醇和降脂活性高于“霜前”白茶样品。

2.4.2 对α-淀粉酶、NO抑制活性分析α-淀粉酶能够将食物中的多糖分解为单糖，进而被人体吸收，使血糖升高。通过抑制α-淀粉酶活性，机体在摄入碳水化合物后的血糖水平浮动程度便会减小[32]。研究表明，茶叶的α-淀粉酶抑制活性主要与茶多酚、茶色素以及咖啡碱等物质的含量有关[33]，因此，茶叶能够抑制多糖分解是众多化合物综合作用的结果。由图4 可见，在体外试验中，“霜前”白茶样品的α-淀粉酶抑制率要极显著高于“霜后”白茶样品。

巨噬细胞在受到脂多糖刺激后，能够诱发脂多糖跨膜信号转导，进而引起一系列的全身炎症反应综合征[34-35]，因此，该体外炎症细胞模型在一定程度上可以反映茶叶的抗炎活性。如图4 所示，两组白茶样品均表现为“霜前”白茶样品NO 抑制率要高于“霜后”白茶，但统计分析结果“霜前”“霜后”白茶样品的抗炎活性无显著差异。

2.4.3 抗氧化活性分析

采用4 种不同的方法，即清除DPPH 自由基法、清除ABTS自由基法、清除超氧阴离子自由基法以及FRAP 法，分析比较了“霜前”“霜后”两组白茶样品的体外抗氧化活性差异。如图5 所示，前3 种方法测得的“霜前”白茶的半抑制浓度IC50均不同程度低于“霜后”白茶（IC50值与抗氧化能力成反比），因此，可知上述3 种评价方法均表明“霜前”白茶的体外抗氧化活性高于“霜后”白茶样品。有研究表明，茶叶中的酯型儿茶素类物质具有较好的抗氧化活性[36]，而本研究中几种代表性酯型儿茶素均呈现出在“霜后”白茶中含量低于“霜前”白茶中含量，因此推测“霜后”白茶中酯型儿茶素含量的降低可能是其抗氧化活性下降的影响因素之一。然而，图5-d 的结果表明，采用FRAP 方法测得的抗氧化活性结果与其他3 种方法的结果存在不同。究其原因，FRAP 法采用分光光度计鉴定颜色的变化，而且其还原能力易受金属离子的影响，因此推测检测时的外界环境因素可能导致了FRAP法结果的差异。

3 小结与讨论

本研究分析了“霜前”“霜后”白茶制品的主要化学成分含量以及生物活性差异情况。感官审评结果表明，“霜后”白茶较“霜前”白茶滋味呈现出清甜（甜醇）、回甘、柔和的品质特点。

化学成分分析结果表明，“霜前”“霜后”白茶在主要化学成分方面有明显差异。相较“霜前”白茶，“霜后”白茶的可溶性碳水化合物、GC等物质含量显著上升；茶多酚含量呈现总体下降趋势，酯型儿茶素中EGCG、GCG、ECG 含量极显著降低；化学成分分析结果与感官审评结果相符。

广靶代谢组学分析表明，“霜前”“霜后”白茶样品中有10 大类共99 种共有差异化合物，对比“霜前”白茶，“霜后”白茶中有49 种差异化合物呈上调趋势，46 种差异化合物呈下调趋势。上调差异化合物中，以D-蔗糖、蜜二糖、D-海藻糖以及水苏糖为代表的糖类物质参与了半乳糖、淀粉及蔗糖代谢过程，是“霜后”白茶中可溶性碳水化合物含量显著上升的主要原因。体外活性试验表明，“霜后”白茶降胆固醇、降血脂活性高于“霜前”白茶，抑制α-淀粉酶、抗氧化活性能力低于“霜前”白茶。

综上，初霜后鲜叶可以制作白茶产品，并在茶汤风味上有独特优势，研究结果可为山东茶区开发早霜、晚霜白茶新产品提供科学依据。