藤茶中二氢杨梅素和杨梅素对体外胃蛋白酶模型建立及活性评价

杨璐 陈仕学 王世青 姚元勇 张萌 黄玉

摘要 为了解藤茶中二氢杨梅素、杨梅素对胃蛋白酶活性的影响，通过探索对体外胃蛋白酶模型建立的影响因素确定建立条件，选用胃蛋白酶—血红蛋白为反应体系，在一定条件下分析胃蛋白酶作用时间、胃环境模拟成分（NaCl溶液、盐酸溶液）、终止剂三氯乙酸、血红蛋白、胃蛋白酶活性的影响因素以及二氢杨梅素和杨梅素对胃蛋白酶活性的影响。结果表明，胃蛋白酶作用时间为10 min、胃环境模拟成分（0.1 mol/L NaCl溶液和0.065 mol/L盐酸溶液）、5 mL血红蛋白溶液（1%）、1 mL胃蛋白酶（0.10 mg/mL）。另外，以不同浓度的二氢杨梅素、杨梅素为实验组，以酶活性变化指标为考察组，考察二氢杨梅素和杨梅素對胃蛋白酶活性的影响。结果为当二氢杨梅素用量为0.05 mg时，对0.1 mg胃蛋白酶有最大抑制作用，空白组酶活力（u）为10 632.322 9，实验组酶活力（u）为695.680 9，抑制率为93.46%；当杨梅素用量为0.15 mg时，对0.1 mg蛋白酶有最大抑制作用，空白组酶活力（u）为10 632.322 9，实验组酶活力（u）为2 260.962 9，抑制率为78.74%。由此可知，二氢杨梅素和杨梅素对胃蛋白酶均有明显的抑制作用，且在同剂量的黄酮参与反应中，二氢杨梅素的抑制率比杨梅素的大，这为后期的具体应用奠定了一定的理论基础。

关键词 二氢杨梅素；杨梅素；胃蛋白酶；酶活力；抑制率

中图分类号 R284.1   文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2023）06-0028-07

Abstract In order to understand the rattan tea dihydrogen arbutus pigment， myricetin influence on pepsin activity， through the exploration of the influence factors of pepsin in vitro model to establish conditions were determined， the selection of pepsin， hemoglobin as reaction system， under certain conditions to explore stomach protease action time， environmental simulation component （NaCl solution， hydrochloric acid solution）， termination of trichloroacetic acid， hemoglobin and the factors influencing the activity of pepsin and dihydrogen arbutus pigment and myricetin on pepsin activity， the results show that： The action time of pepsin was 10 min， the simulated components of gastric environment （0.1 mol/L NaCl solution and 0.065 mol/L hydrochloric acid solution）， 5 mL hemoglobin solution （1%）， and 1 mL pepsin （0.10 mg/mL）.In addition， the effects of dihydromyricetin and myricetin at different concentrations on pepsin activity were investigated by taking dihydromyricetin and myricetin as the experimental group and the change of enzyme activity as the study group.The results showed that dihydromyricetin had the largest inhibitory effect on 0.1 mg pepsin when the dosage was 0.05 mg， the enzyme activity （u） of the blank group was 10 632.322 9， and the enzyme activity （u） of the experimental group was 695.680 9， with an inhibition rate of 93.46%.When the dosage of myricetin was 0.15 mg， it had the maximum inhibition effect on the protease of 0.1 mg， the enzyme activity （u） of the blank group was 10 632.322 9， and the enzyme activity （u） of the experimental group was 2 260.962 9， and the inhibition rate was 78.74%.It can be seen that both dihydromyricetin and myricetin have obvious inhibitory effects on pepsin， and the inhibition rate of dihydromyricetin is higher than that of myricetin in the reaction with the same dose of flavonoids， which provides certain theoretical basis for the specific application in the later stage.

Keywords dihydromyricetin; myricetin; pepsin; enzyme activity; inhibition rate

胃蛋白酶是胃中唯一的蛋白质水解酶，是机体中重要的消化酶之一。蛋白质由食道进入胃后，首先经胃蛋白酶水解成多肽，部分多肽再被蛋白酶分解为酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸，最后被人体吸收。部分药物进入胃后，会改变胃蛋白酶的活性环境，最终对胃蛋白酶的活性以及药物在体内的分布与代谢产生重要影响。

藤茶作为药食两用植物，主要分布于我国长江流域以南的广东、广西、湖南、江西、贵州等省区[1]，具有清热、消炎、降血糖、降血脂等功效[2]。二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DMY）、杨梅素（Myricetin，MYR）占藤茶中总黄酮含量的30%左右[3]，其结构如图1所示。近年来，有关二氢杨梅素和杨梅素的生物活性研究较多，均表明二氢杨梅素和杨梅素具有优良的生物活性，二氢杨梅素和杨梅素成分在消炎、镇痛、抗高血压、保肝护肝及解酒、增强免疫力、抗氧化和抑菌[4-10]等方面均表现出较好的生物活性作用，是具有潜在开发价值的一类天然药物。然而，大多数药物的治疗途径都需经过胃的吸收进入血液，进而送达病灶部位发挥药效。因此，研究黄酮醇类化合物二氢杨梅素和杨梅素对胃蛋白酶活性的影响具有良好的临床应用价值。

目前，关于黄酮类或黄酮醇类天然产物对胃蛋白酶的活性影响研究报道较少，梁会丽[11]报道了木犀草素、川陈皮素、染料木素、水飞蓟宾、野黄芩苷、大豆甙元、金丝桃苷、葛根素、甘草素、桑色素、芹菜素、山萘酚、槐角苷、槲皮素、黄芩素、黄芩苷、柚皮素、柚皮苷、芦丁共19种黄酮化合物对胃蛋白酶活性的研究，指出19种黄酮化合物对胃蛋白酶有明显的抑制作用；秦湉等[12]报道了对鲤鱼胃蛋白酶和大肠淀粉酶活性的研究，并指出二氢杨梅素对胃蛋白酶的活性有提高作用，对大肠淀粉酶有抑制作用。

本文通过建立体外胃模拟模型，进一步考察DMY、MYR对胃蛋白酶活力的影响及量效关系，测定了DMY、MYR对胃蛋白酶活力的抑制作用，可为后期天然黄酮醇类化合物的开发应用提供重要的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料：藤茶（来源于铜仁学院藤茶种植基地）。

试剂：杨梅素（天津希恩思生化科技有限公司），二氢杨梅素（铜仁学院材料与化学工程学院应用化学研究所），胃蛋白酶（上海源叶生物科技有限公司），血红蛋白、酪氨酸（上海麦克林生化科技有限公司），三氯乙酸（天津市光复精细化工研究所），氯化钠（天津市鼎盛鑫化工有限公司），盐酸（成都金山化学试剂有限公司），乙醇（上海润捷化学试剂有限公司）。

仪器：759S紫外可见分光光度计（上海棱光科技有限公司），RC-3溶出度测试仪（天津市精拓仪器科技有限公司），BSA224S分析天平（北京赛多利斯科学仪器），TG20KR-D离心机（贵州科辉科学器材有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 体外胃模拟模型的建立。为了进一步获得科学性的体外胃模拟模型建立数据，实验分别以胃蛋白酶作用时间、胃环境模拟成分（NaCl溶液、盐酸溶液）、终止剂（三氯乙酸）、血红蛋白及胃蛋白酶为研究对象，对体外胃模拟模型建立的因素进行讨论分析。

1.2.1.1 溶液配制。0.02 mg/mL胃蛋白酶溶液，称0.2 mg胃蛋白酶溶于10 mL稀盐酸溶液（0.065 mol/L）；0.5 mg/mL酪氨酸溶液，称5 mg酪氨酸溶于10 mL稀盐酸溶液（0.065 mol/L）；1%血红蛋白溶液，称0.1 g血红蛋白溶于10 mL氯化钠溶液（0.1 mol/L），5%三氯乙酸溶液，称0.5 g三氯乙酸溶于10 mL蒸馏水。

1.2.1.2 实验操作。（1）胃蛋白酶作用时间的优化：向胃模拟反应容器A、B、C中加入5 mL 1%血红蛋白溶液于37 ℃保温10 min后，加入0.02 mg/mL胃蛋白酶溶液1 mL，A、B、C搅拌反应时间分别为10、30、60 min，最后加入5%三氯乙酸5 mL搅匀，离心取清液，使用紫外可见分光光度计在190～1 100 nm进行全波长扫描。（2）胃环境模拟成分NaCl、盐酸及终止剂三氯乙酸的影响分析：取0.1 mol/L氯化钠溶液、0.065 mol/L稀盐酸溶液、5.0%的三氯乙酸各10 mL于胃模拟反应容器中37 ℃保温10 min，使用紫外可见分光光度计在190～1 100 nm进行全波长扫描。（3）盐酸对胃蛋白酶、血红蛋白的影响分析：取0.02 mg/mL的胃蛋白酶溶液10 mL于溶出仪中37 ℃保温10 min，使用紫外可见分光光度计在190～1 100 nm进行全波长扫描。实验组1：取5 mL 1%血红蛋白溶液转移至胃模拟反应容器A中，恒温37 ℃，保温10 min。然后，向胃模拟反应容器A中加入1 mL稀盐酸（0.065 mol/L）溶液，恒温蠕动10 min，再向反应器A中加入5 mL 5%三氯乙酸，搅匀，离心取清液。对照组1：取5 mL 0.5 mg/mL酪氨酸溶液分别转移至胃模拟反应容器B中，恒温37℃，保温10 min。然后，向胃模拟反应容器B中加入1 mL稀鹽酸（0.065 mol/L）溶液，恒温蠕动10 min，再向反应器B中加入5 mL 5%三氯乙酸，搅匀，离心取清液。对照品：向胃模拟反应容器中，加入5 mL 1%血红蛋白溶液于37 ℃保温10 min后，加入0.5 mg/mL酪氨酸溶液1 mL，搅拌反应10 min，最后加入5%三氯乙酸5 mL搅匀，离心取清液。供试品：向胃模拟反应容器中加入5 mL 1%血红蛋白溶液于37 ℃保温10 min后，加入0.02 mg/mL胃蛋白酶溶液1 mL，搅拌反应10 min，最后加入5%三氯乙酸5 mL搅匀，离心取清液。使用紫外可见分光光度计在190～1 100 nm进行全波长扫描。（4）胃蛋白酶浓度的优化：分别配制0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.22 mg/mL胃蛋白酶溶液备用。对照品空白：向胃模拟反应容器中加入5 mL 1%血红蛋白溶液于37 ℃保温10 min后，再向胃模拟反应容器中加入5%三氯乙酸5 mL搅匀，最后加入0.065 mol/L盐酸溶液1 mL，搅拌反应10 min，离心取清液。供试品空白：向胃模拟反应容器中加入5 mL 1%血红蛋白溶液于37 ℃保温10 min后，再向胃模拟反应容器加入5%三氯乙酸5 mL搅匀，最后加入各浓度胃蛋白酶溶液1 mL，搅拌反应10 min，离心取清液。供试品：向胃模拟反应容器中加入5 mL 1%血红蛋白溶液于37 ℃保温10 min后，加入各浓度胃蛋白酶溶液1 mL，搅拌反应10 min，最后加入5%三氯乙酸5 mL搅匀，离心取清液。对照品操作同盐酸因素对胃蛋白酶、血红蛋白影响分析中的对照品使用紫外-可见分光光度计在275 nm处测定吸光度值。

1.2.2 体外胃蛋白酶反应体系的影响分析、活力评价。（1）DMY和MYR对体外胃蛋白酶反应体系的影响分析：配制0.025 mg/mL的二氢杨梅素和同浓度的杨梅素溶液于胃模拟反应容器中37 ℃保温10 min，使用紫外可见分光光度计在190～1 100 nm进行全波长扫描。（2）DMY和MYR对胃蛋白酶活力的评价：分别配制浓度为1.25、2.50、3.75、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 mg/mL的二氢杨梅素和同浓度的杨梅素乙醇溶液备用。供试品空白：向胃模拟反应容器中加入5 mL 1%血红蛋白溶液于37 ℃保温10 min后，再向胃模拟反应容器加入5%三氯乙酸5 mL搅匀，最后加入0.10 mg/mL胃蛋白酶溶液1 mL和10 μL不同浓度的DMY、MYR溶液，搅拌反应10 min，离心取清液。供试品：向胃模拟反应容器中加入5 mL 1%血红蛋白溶液于37 ℃保温10 min后，加入胃蛋白酶溶液1 mL和10 μL不同浓度的DMY、MYR溶液，搅拌反应10 min，最后加入5%三氯乙酸5 mL搅匀，离心取清液。对照品空白操作同胃蛋白酶浓度因素优化中的对照品空白、对照品操作同盐酸因素对胃蛋白酶、血红蛋白影响分析中的对照品。使用紫外-可见分光光度计在275 nm处测定吸光度值。胃蛋白酶活性评价标准如下：

胃蛋白酶活力值=（Ai×WS×n）/（AS×W×10×181.19） （1）

式中，Ai为供试品平均吸光度（=供试品-供试品空白）；WS为每1 mL酪氨酸溶液中酪氨酸的量，ug；AS为对照品平均吸光度（=对照品-对照品空白）；W为胃蛋白酶的取样量，g；n为供试品稀释倍数。

抑制率（%）=（空白胃蛋白酶活力值-含DMY/MYR胃蛋白酶活力值）/空白胃蛋白酶活力值 （2）

2 结果与分析

2.1 体外胃模拟模型建立

2.1.1 体外胃模拟模型建立的影响因素分析。（1）胃蛋白酶作用时间的选择。根据1.2.1.1实验操作（1），结果见图2。由图2可知，随胃蛋白酶作用时间的延长，在紫外吸收275 nm处，均有不同程度的吸收响应。其中，相比作用时间10 min与30 min的吸收响应值而言，两者吸收响应值相近。然而，对比作用时间60 min的吸收响应值，其吸收响应值相对较大，说明该因素对体外胃模拟模型的建立有一定的影响，其原因可能为反应体系中的酸性会造成血红蛋白的分解，从而导致吸光度响应值增大。因此，选择胃蛋白酶的最佳作用时间10 min为因素。

（2）胃环境模拟成分NaCl、盐酸及终止剂三氯乙酸的影响分析。根据1.2.1.2的操作步骤（2）进行具体实验，结果见图3。由图3可知，NaCl溶液作为血红蛋白的溶剂，盐酸溶液分别作为胃蛋白酶和酪氨酸的溶剂，在紫外吸收275 nm处，可观察到NaCl和盐酸均无明显吸收峰；另外，还考察终止剂三氯乙酸（可与血红蛋白结合，沉淀血红蛋白，终止反应）对模型体系的影响，在275 nm处也未发现明显的吸收峰。由此可见，胃环境模拟成分NaCl、盐酸及终止剂三氯乙酸在体外胃模拟模型建立试验均无影响，均可忽略不计。

（3）盐酸对胃蛋白酶、血红蛋白的影响分析。根据1.2.1.2操作步骤（3）进行实验，结果见图4。由图4可知，在吸收波长为275 nm处，可明显地观察到盐酸对胃蛋白酶在胃模拟环境中位产生相应的吸收响应，从而说明盐酸这一因素对胃蛋白酶无分解作用；另外，在盐酸对血红蛋白的影响实验中，实验组1在275 nm处有特征吸收峰，和对照组1中酪氨酸出峰波长接近，且这2组出峰波长均与供试品和对照品的出峰波长接近。由此说明，盐酸对血红蛋白有一定影响，可使血红蛋白水解产生氨基酸。因此，在整个反应体系中应考虑盐酸对血红蛋白产生的影响。

（4）胃蛋白酶浓度的选择。根据1.2.1.2操作步骤（4）进行实验，结果见图5。由图5可知，在相同1%血红蛋白-胃蛋白酶的反应体系中，随着胃蛋白酶浓度的增加，单位酶活力有所增加，当其浓度增加到0.1 mg/mL时胃蛋白酶活力值达到最大，继续增加胃蛋白酶浓度活力值逐渐减小，这可能与供试品空白的吸光度值有关，供试品空白中提前加入三氯乙酸的目的是终止反应，但出现胃蛋白酶浓度增加活力值降低的现象，可能是因为反应中三氯乙酸未将血红蛋白完全沉淀，从而导致胃蛋白酶浓度越高，供试品空白吸光度越高，活力值减小的现象。根据2015版《中国药典》第二部规定，按干燥品計算，每1 g中含胃蛋白酶活力不得少于3 800单位。在上述不同胃蛋白酶浓度反应体系中，只有胃蛋白酶浓度0.02 mg/mL时活力值未达到3 800，且当浓度为0.10 mg/mL时，酶活力值最大，之后随浓度增加而降低。因此，0.10 mg/mL作为体外胃模拟实验胃蛋白酶的最佳反应浓度。

2.1.2 体外胃模拟模型建立的影响因素确定。综合以上影响因素分析，构建体外胃模拟模型的影响因素，结果见图6。由图6可知，构建体外胃模拟模型因素可确定为：胃蛋白酶作用时间为10 min、胃环境模拟成分（0.1 mol/LNaCl溶液和0.065 mol/L盐酸溶液）、5 mL血红蛋白溶液（1%）、1 mL胃蛋白酶（0.10 mg/mL）。

2.2 体外胃蛋白酶反应体系的影响分析及对胃蛋白酶活力评价

2.2.1 DMY、MYR对体外胃蛋白酶反应体系的影响分析。根据1.2.2操作步骤（1）进行实验，结果见图7。由图7可知，DMY特征吸收峰在290 nm左右，MYR特征吸收峰在330 nm左右，而本实验用于测定反应中产生酪氨酸的波长为275 nm，它们之间的吸收峰未出现重合和叠加现象，且供试品的吸收峰虽然较弱，但依然和对照品吻合出峰，波长为275 nm。因此，在考察DMY、MYR对胃蛋白酶活性的影响中，检测酪氨酸生成时，并不会对反应生成的酪氨酸的吸光度响应值造成误差影响。

2.2.2 DMY、MYR对胃蛋白酶活力评价及作用机制初步分析。（1）DMY、MYR对胃蛋白酶活力评价。根据1.2.2的操作步骤（1）进行实验，结果见图8和图9。由图8和图9可以得出，二氢杨梅素和杨梅素对胃蛋白酶活性均有抑制作用，当二氢杨梅素用量为0.05 mg时，对0.1 mg胃蛋白酶有最大抑制作用，胃蛋白酶活力值（u）为695.680 9，抑制率为93.46%；杨梅素用量为0.15 mg时，对0.1 mg胃蛋白酶有最大抑制作用，胃蛋白酶活力值（u）为2 260.962 9，抑制率为78.74%。

（2）DMY、MYR分子构型对胃蛋白酶活性影响机制初步分析。由图10可知，杨梅素和二氢杨梅素含有相同的羟基数目，且在反应中除2种黄酮本身的不同外，其他所处的条件都相同，唯一的不同点是杨梅素与二氢杨梅素的母核结构不同。杨梅素为平面结构，排列较为紧密，分子间引力较大，不利于外源分子进入，导致水溶性低，不利于和蛋白质抢夺酶的结合位点；二氢杨梅素具有空间结构，系非平面分子，分子间引力降低，有利于外源分子进入导致水溶性优于杨梅素，有利于和蛋白质抢夺酶的结合位点。又由DMY、MYR对胃蛋白酶活力影响评价可知，在相同剂量黄酮参与的胃蛋白酶反应中，二氢杨梅素的抑制率比杨梅素抑制率大，而且在含有相同羟基数目的情况下，母核结构为二氢黄酮的活性优于黄酮活性。因此，二氢杨梅素对胃蛋白酶活性的抑制率大于杨梅素。这一结果与梁会丽[11报道的在含有相同羟基的情况下，母核为二氢黄酮的活性比黄酮和异黄酮活性要强]结论相一致。

3 结论

本研究主要探讨了藤茶中二氢杨梅素、杨梅素对胃蛋白酶活性的影响，通过探索对体外胃蛋白酶模型建立的影响因素确定建立条件，选用胃蛋白酶—血红蛋白为反应体系，在一定条件下分析胃蛋白酶作用时间、胃环境模拟成分（NaCl溶液、盐酸溶液）、终止剂三氯乙酸、血红蛋白及胃蛋白酶活性的影响因素及二氢杨梅素和杨梅素对胃蛋白酶活性的影响，结果表明：胃蛋白酶作用时间为10 min、胃环境模拟成分（0.1 mol/LNaCl溶液和0.065 mol/L盐酸溶液）、5 mL血红蛋白溶液（1%）、1 mL胃蛋白酶（0.10 mg/mL）。另外，以不同浓度的二氢杨梅素、杨梅素考察对胃蛋白酶活性的影响。结果为：二氢杨梅素用量为0.05 mg时对0.1 mg胃蛋白酶有最大抑制作用，空白組酶活力（u）为10 632.322 9，实验组酶活力（u）为695.680 9，抑制率为93.46%；杨梅素用量为0.15 mg时对0.1 mg蛋白酶有最大抑制作用，空白组酶活力（u）为10 632.322 9，实验组酶活力（u）为2 260.962 9，抑制率为78.74%。由此可知，二氢杨梅素和杨梅素对胃蛋白酶都有明显的抑制作用，且在同剂量的黄酮参与反应中，二氢杨梅素的抑制率比杨梅素的大，其原因可能是在含有羟基数目相同的情况下，母核结构为二氢黄酮的活性优于黄酮活性，且二氢杨梅素对胃蛋白酶活性的抑制作用大于杨梅素。本文的研究将在临床上对胃肠道疾病诊断具有重大意义，可为研究临床应用中黄酮类化合物引起消化不良反应奠定一定的基础，同时也为黄酮类化合物与胃蛋白酶相互作用机理研究提供科学依据，并为黄酮类作为功能性食品的开发和应用起指导作用。

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（责编：张宏民）

基金项目 贵州省教育厅创新群体重大研究项目（黔教合KY字[2018]033）；贵州省千层次创新型人才（2017-2015-015）。

作者简介 杨璐（1998—），女，贵州铜仁人。研究方向：天然产物提取及应用。