产前应激对子代大鼠心脏代谢物轮廓变化的影响

张 力,孙宏利,高艳娥,蔡东阁

(1.西安交通大学第二附属医院妇产科,陕西西安 710004;2.西安市儿童医院,陕西省儿科疾病研究所,陕西西安 710003)

产前环境对机体的发育有深远的影响,怀孕期间的应激事件,即产前应激(prenatal stress,PS),会给后代带来长期的生理和行为的改变[1-2]。流行病学证据表明,宫内生长受限与子代出生体质量和成年时期的心血管疾病之间密切相关[3]。目前,临床根据心率变异性和唾液皮质醇来检测孕妇的压力水平得到良好的实验室证据支持[4]。本课题组前期实验结果表明,暴露于PS后的子代大鼠在强迫游泳实验中不动时间显著增加,在旷场实验中穿越总格数显著减少,在糖水偏好实验中糖水消耗量显著减少,这些实验结果表明PS 可导致子代大鼠抑郁样行为的发生[5]。PS可通过改变胎儿糖皮质激素水平降低神经系统的发育,从而控制胎儿心率[6]。大量临床实验结果表明,心血管疾病患者常伴随着心理压力,严重者可导致抑郁症的发生[7-10]。由此可见,PS对心脏发育有着明显的不利影响,然而,其潜在的生物学机制有待进一步探讨。

代谢组学诞生于上个世纪末,由英国伦敦帝国大学JEREMY NICHOLSON 教授提出[11],主要研究生命体对外界刺激、病理生理变化以及本身基因突变而引起的分子质量小于1 500 Da以内的代谢产物(内源性代谢物)种类、数量及其变化规律的科学。小分子在人体内的作用一直被忽视。近年来,随着代谢组学的发展,为探索这些小分子的变化提供了便利。特别是UHPLC-Q-TOF/MS方法,该方法在代谢组学研究中得到了广泛的应用,其特点是用1.7μm 超细粒径填料填充色谱柱,其速度至少比传统HPLC分析快1倍,灵敏度和分离度是传统HPLC分析的数倍并能提供中心碳循环代谢的最大信息。通过代谢组技术分析实验组与对照组的代谢水平差异,找出差异代谢物,有助于生物标志物的筛选,或研究差异代谢物参与的生物过程(通过代谢通路逆推找出调节酶和基因),揭示其参与的生命活动的机制,完成调控通路等方面的研究。目前,代谢组学分析法广泛应用于心血管疾病、胃肠道疾病和肝脏疾病等[12-14]。

本研究基于高分辨非靶向代谢组学分析PS 对子代大鼠心脏的代谢物轮廓的变化,并通过KEGG通路富集与对照组进行比对,筛选出关键信号通路和关键分子,探讨其在暴露于PS后子代大鼠心脏发育中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验选用Sprague-Dawley大鼠共12只,购于西安交通大学医学部实验动物中心,体质量230～300 g,置于温度为18～25℃,湿度45%～65%,暗/光环境12 h/12 h饲养1周,整个实验过程大鼠可自由饮食、饮水。1周后将雌性和雄性大鼠按3∶1的比例于晚上20:00-22:00期间混合饲养,并在次日早上7:00-8:00对雌性大鼠进行阴道涂片检查,检出精子呈阳性,则将母鼠单笼饲养并记录为妊娠第0天。所有妊娠大鼠随机分组为产前应激(PS)组(妊娠14 d～20 d期间,孕鼠每天8:00-19:00给予3次束缚应激,相邻两次应激时间间隔不少于2 h,每次应激时长为45 min[15])和对照(CON)组(孕期不给予任何处理)。分娩后,待子鼠1月龄时,对照组和实验组分别选取6只雄性子代大鼠进行实验(每窝随机挑选1～2只子鼠)。动物实验经西安市儿童医院动物伦理委员会审批(审批号:国2017001)。

1.2 UHPLC-Q-TOF/MS分析

用戊巴比妥钠(60 mg/kg,腹腔注射)麻醉动物。在冰上立即取出大鼠心脏组织。用PBS冲洗心脏组织(60 mg),与800μL 冷甲醇/乙腈(1∶1,V/V)混合以去除蛋白质。混合物在4℃下超声30 min两次,在-20℃下静置1 h,离心15 min(13 000×g,4℃)。将上清液真空干燥,加入100μL 乙腈/水(1∶1,V/V)复溶,然后离心15 min(14 000×g,4℃)。取出上清液用于UHPLC-Q-TOF/MS分析。使用安捷伦1290 Infinity液相色谱系统(Agilent Technologies,Santa-Clara,California,USA)与安捷伦6550(Agilent Technologies,Santa-Clara,California,USA)和AB SCIEX 三重TOF 6600系统(AB SCIEX,Framingham,MA,USA)进行联合分析。在UHPLC-QTOF/MS检测过程中,通过从每个样品中获取5 mg来制备质量控制(QC)样品,并在样品注入前用于测试仪器状态和平衡色谱-质谱系统,以及用于评估整个实验过程中的系统稳定性。

色谱分离使用2.1 mm×100 mm ACQUIY UHPLC BEH 1.7 m 色谱柱(waters,Ireland)在ESI正负模式下分析样品,柱温设置为25℃,流速为0.3 m L/min,进样体积为2μL。流动相的组成如下:A=25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L 氢氧化铵水溶液,B=乙腈。梯度在0.5 min内为95%B,在7 min时线性降低到65%,然后在8 min 时降低到40%并保持1 min,然后在0.1 min内增加到95%,使用3 min的再平衡时间。

UHPLC分离后,从Agilent 6550获得了ESI正负模式下的质谱信息。ESI源条件设置如下:气体Tem 250℃,干燥气体16 L/min,雾化器20 psig,鞘气Tem 400℃,鞘气流量12 L/min,vcap 3000 V,喷嘴电压0 V。碎片175 V,质量范围50～1 200,采集速率4 Hz,循环时间250 ms。在测试样品后,通过AB Triple TOF 6600在质谱和MS/MS谱的ESI阳性和阴性模式下进行代谢物的鉴定。ESI源条件设置如下:离子源gas1(Gas1)40,离子源gas2(Gas2)80,幕帘气体(CUR)30,源温度650℃,离子分离电压浮动(ISVF)5 000 V。MS/MS谱通过信息相关采集(IDA)在高灵敏度模式下采集,去簇电位(DP)60 V,碰撞能量(35±15)ev。IDA 设置如下:排除4 Da内的同位素,每个周期监测的候选离子10。为了扩大MS/MS谱图的采集速率,数据采集按质量范围分为4 段(50～300,290～600,590～900,890～1 200),每种方法每段采集4个重复。采用自建库Met-DDA 和LipDDA(Shanghai Applied Protein Technology Co.,Ltd.)方法对代谢物结构进行鉴定。

1.3 生物信息学分析

使用XCMS 程序ProteoWizard MSConvert将原始UPLC-Q-TOF/MS数据转换成mzXML 格式,用于特征检测、保留时间校正和比对。Minfrac被设置为0.5。代谢物通过与实验室数据库匹配的精确质量数(m/z tolerance±30 ppm,RT tolerance±60 s)和MS/MS 数据进行鉴定。在使用SVR 和Peratoscaling方法进行归一化和整合之后,将处理后的数据导入SIMCA-P 14.1(Umetrics,Umea,Sweden)进行多变量统计分析,包括主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)以及正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。进行典型的7重交叉验证和200 次迭代排列测试来验证PCA、PLS-DA 和OPLS-DA 模型。基于OPLS-DA 模型和对原始数据进行Two-tailedttest获得VIP值和P值的统计确定显著差异的代谢物,VIP 值大于1.0且P值小于0.05的代谢物被认为是显著的。鉴定的差异代谢物随后被上传到KEGG 数据库(http://www.genome.jp/kegg/)进行信号通路和主导网络分析。

2 结 果

2.1 UHPLC-Q-TOF/MS分析的质量控制

MCC是一种基于所有X 变量组合的多变量控制图,可以显示随时间测量的数据,并监控实验过程中的变化。MCC中的每个点代表一个QC样本。一般在正负3个标准差范围内都是合理的(图1A)。皮尔逊相关分析的结果显示QC 样本具有良好的相关性(相关指数＞0.9,图1B)。T2分析检测是否存在异常样本,如图1C 所示,所有样本都在99%的置信区间内。图1D 将实验样本和QC 样本提取得到的峰进行PCA 分析,结果表明QC 样本紧密聚集在一起,说明实验的重复性好。所有这些结果证明,UHPLC-Q-TOF/MS分析的质量控制是严格的,所有数据是客观可靠的,适用于后续进一步的分析。

图1 UHPLC-Q-TOF/MS分析的质量控制Fig.1 Quality control of UHPLC-Q-TOF/MS analysis

2.2 基于UHPLC-Q-TOF/MS的心脏组织代谢谱分析

PS组和CON 组大鼠心脏样品的UHPLC-QTOF/MS代谢组学图谱在正负离子模式合并后鉴定1 602种代谢物,其中正负离子模式下分别产生总共779和823 个离子峰。PCA 得分图显示了PS 组和CON 组之间无统计学差异(R2X=0.517,图2A),PLS-DA 评分图显示了PS组和CON 组之间没有统计学差异(R2X=0.442,R2Y=0.949,Q2=0.601,图2B)。进一步采用OPLS-DA 模式分析,结果显示两组间有统计学差异(R2X=0.442,R2Y=0.949,Q2=0.004 86,图2C)。图2D 是OPLS-DA 模型置换 检验图,随着置换保留度逐渐降低,随机模型的R2和Q2(R2=0.816 9,Q2=-0.231 2)均逐渐下降,说明原模型不存在过拟合现象,模型稳健性良好。

图2 PS组和CON 组大鼠心脏组织的代谢组学分析Fig.2 Metabolomic analysis of heart tissue in PS and CON groups

2.3 PS组和CON组大鼠心脏组织代谢差异物的分析

以OPLS-DA VIP＞1和P＜0.05 为显著性差异代谢物筛选标准,在两组心脏组织中共鉴定出19种差异代谢物。19种代谢物的丰度在PS组大鼠和CON组中是不同的,用层次聚类热图分析显示(图3)。聚在同一簇内的代谢物具有相似的表达模式,可能具有相似的功能或者共同参与同一代谢过程或者细胞通路。

图3 PS组和CON 组大鼠显著性差异代谢物层次聚类热图Fig.3 Significant differences in metabolite hierarchical clustering heat map between rats in PS and CON groups

2.4 基于KEGG 的差异代谢物的生物信息学分析

PS组和CON 组大鼠之间显著性差异代谢物(VIP＞1,P＜0.05)的KEGG 通路注释结果如图4所示。前10个显著变化的信号通路分别是氨基酸的生物合成、嘌呤代谢、嘧啶代谢、丙氨酸/天冬氨酸盐和谷氨酸代谢、c AMP信号通路、精氨酸的生物合成、GABA 能突触、谷氨酸能突触、尼古丁成瘾和肌动蛋白细胞骨架调节。其中富集在嘌呤代谢、嘧啶代谢和精氨酸的生物合成通路中的L-谷氨酰胺、假尿嘧啶、胞氨酸3＇-单磷酸、胞氨酸5＇-单磷酸、尿酸、2＇-脱氧腺苷5＇-单磷酸、黄嘌呤、精氨琥珀酸显示出更为显著的统计学差异。

图4 KEGG 富集通路图Fig.4 Diagram of KEGG enrichment pathway

3 讨 论

研究报道慢性束缚应激可诱导心脏重塑和心律失常,可能是通过改变与DCM 和ASPC通路相关的心肌基因的甲基化[16]。本实验采用产前束缚应激模型,研究PS 对子代大鼠心脏代谢物轮廓变化的影响。结果显示,与对照组相比,PS组子代大鼠心脏组织中显著变化的信号通路包括氨基酸的生物合成、嘌呤代谢、嘧啶代谢、丙氨酸/天冬氨酸盐和谷氨酸代谢、c AMP 信号通路、精氨酸的生物合成、GABA 能突触、谷氨酸能突触、尼古丁成瘾和肌动蛋白细胞骨架调节。其中富集在嘌呤代谢、嘧啶代谢和精氨酸的生物合成通路中的L-谷氨酰胺、假尿嘧啶、胞氨酸3＇-单磷酸、胞氨酸5＇-单磷酸、尿酸、2＇-脱氧腺苷5＇-单磷酸、黄嘌呤、精氨琥珀酸可能是主要参与PS影响子代大鼠心脏发育的生物分子。

L-谷氨酰胺在心血管生理和病理中起着重要作用[17]。作为DNA、ATP、蛋白质和脂类合成的底物,L-谷氨酰胺驱动着血管细胞的关键过程,包括增殖、迁移、凋亡、衰老和细胞外基质沉积。此外,L-谷氨酰胺可通过诱导血红素氧合酶-1、热休克蛋白和谷胱甘肽的表达,在循环中发挥强大的抗氧化和抗炎作用。L-谷氨酰胺还可以作为l-精氨酸前体优化一氧化氮合成,从而促进心血管健康。更为重要的是,L-谷氨酰胺可减轻心血管疾病的许多危险因素,如高血压、高脂血症、葡萄糖不耐受、肥胖和糖尿病。许多研究表明,补充L-谷氨酰胺可预防心脏代谢疾病、缺血-再灌注损伤、镰状细胞病、不良刺激引起的心脏损伤,并可能对心力衰竭患者有益[18-21]。然而,过量的L-谷氨酰胺可以促进异常的血管生成和肺动脉高压的发展。在这些情况下,L-谷氨酰胺水解酶的靶向治疗,如谷氨酰胺酶-1、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶和氨基酸转氨酶在动物模型中显示出了应用的前景[17]。

假尿嘧啶是t RNA 和r RNA 中最常见的修饰核苷,被认为可以改善RNA 分子的结构完整性,促进磷酸基的刚性和增强碱基的堆叠。与年龄匹配的健康对照组相比,在射血分数降低的心力衰竭患者中发现了更高的假尿嘧啶血浆浓度[22]。早期的研究表明,当与利钠肽相比较时,假尿嘧啶对射血分数降低的患者具有更好的诊断能力[23]。而N 末端前体利钠肽是目前临床用于促进心力衰竭诊断的“金标准”代谢物。因此,假尿嘧啶不仅有助于心衰病例的诊断,而且这种代谢物的测量也有可能作为一种新的临床工具来识别无疾病但未来心衰风险高的个体。

黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤氧化成尿酸[24]。尿酸是人类嘌呤代谢的最终产物,不仅是痛风的病因,而且在心血管疾病的发展中发挥作用[25-26],如高血压、心房纤颤、慢性肾病、心力衰竭、冠状动脉疾病和心血管死亡。基础实验研究已经确认尿酸是一种抗氧化剂[27],尿酸可诱导血管内皮细胞和平滑肌细胞炎症,以及细胞内氧化应激,导致内皮功能障碍。在嘌呤代谢过程中,黄嘌呤氧化酶的活性产生氧,促进炎症反应,损害内皮功能。内皮作为一种内分泌器官,分泌血管扩张剂和血管收缩剂,调节血管张力、血栓形成、炎症和氧化[28]。内皮功能障碍是指内皮源性血管扩张因子和血管收缩因子之间的不平衡干扰内稳态的一种情况。尽管存在诸多混杂因素,在不同人群中,通过不同的内皮功能测试(如流量介导的扩张、反应性充血指数和冠状动脉内乙酰胆碱测试)评估,尿酸水平升高与内皮功能障碍显著相关。尽管尿酸本身是否是引发炎症、氧化应激和内皮功能障碍的因果关系仍有争议,但这些途径目前是尿酸与心血管疾病之间关系的假设机制。

综上所述,本研究结果显示PS可导致子代大鼠心脏组织中L-谷氨酰胺、假尿嘧啶、尿酸、黄嘌呤、2＇-脱氧腺苷5＇-单磷酸、胞氨酸3＇-单磷酸、胞氨酸5＇-单磷酸水平上调,精氨琥珀酸水平下调。根据文献报道,L-谷氨酰胺、假尿嘧啶、尿酸、黄嘌呤与心血管疾病密切相关,后续实验有待进一步证明PS与心血管疾病的功能性验证。2＇-脱氧腺苷5＇-单磷酸、胞氨酸3＇-单磷酸、胞氨酸5＇-单磷酸水、精氨琥珀酸尚未见报道与心血管疾病相关,这些分子为研究PS与子代大鼠心脏疾病相关的实验提供了新思路。