外泌体在肝细胞癌耐药中的研究进展

李绍麟，赵辰戈

116001 辽宁 大连，大连大学附属中山医院 心血管内科（李绍麟）；517000 广东 河源，暨南大学附属第五医院 药学部（赵辰戈）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）约占原发性肝癌的90%，是世界范围内最常见的肿瘤之一，也是癌症患者死亡的主要原因之一［1］。早期HCC患者的一线治疗，即手术切除，5年生存率为70%，但由于HCC在早期阶段无症状，导致超过50%的患者在诊断时已经是晚期肝癌。在美国食品药品监督管理局批准的晚期肝癌治疗方法中，手术切除、射频消融术和经动脉化疗栓塞术等方案均存在易复发的缺陷［2］。近年来，用于HCC治疗的分子靶向药物的开发取得了重大进展，包括广谱酪氨酸激酶抑制剂，如索拉非尼和乐伐替尼，以及免疫治疗和抗血管生成治疗的组合，即阿替祖单抗和贝伐珠单抗也表现出了出色的疗效［3］。然而，长期的药物治疗中不仅会引起对多器官的毒副作用，最重要的是出现了耐药性。

大多数HCC患者最终会出现耐药性，导致预后不良。在药物的全身治疗中发现的不良事件主要包括胃肠道、心脏和肾脏毒性，以及皮肤损害等，严重时可能会出现高血压和剧烈腹痛导致治疗中断［4］。因此，为了提高药物利用率，改善肿瘤的化疗耐药对HCC的治疗有着重要的意义。最近的研究表明，表观遗传学、细胞内药物浓度的改变、调节性细胞死亡和肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是HCC化疗耐药性发生和发展中的重要因素，外泌体作为一种细胞间传递信息的功能介质，携带的物质可以调节多种生物活动，在HCC进展中扮演着重要角色［5］。

细胞外囊泡根据其大小和生物发生机制分为不同的类型。被广泛研究的主要类型包括外泌体（直径 40 ～ 160 nm）、微粒（直径 100 ～ 1 000 nm）、凋亡小体（1 ～ 5 μm）和癌小体（1 ～ 10 μm）等［6］。在这些种类中，外泌体因其独特的生物发生和功能而备受关注。外泌体作为细胞间的通讯介质，因其特有的脂质双分子层结构，从而可以转运蛋白质、DNA、脂质以及编码和非编码RNA （non-coding RNA，ncRNAs）等物质并保护其不被酶降解，通过自分泌和旁分泌相互作用调节多种细胞过程［7］。越来越多的研究表明外泌体在HCC的进展、转移和耐药中发挥重要作用。在此基础上，研究外泌体在HCC化疗耐药中的作用机制，以及开发外泌体作为天然载体改善HCC耐药有着广阔的前景［8］。

1 外泌体介导的肿瘤耐药

耐药性一直是影响HCC治疗效果的重要因素。手术与化疗相结合是HCC目前标准的一线治疗策略。虽然大多数患者最初对铂类化疗药物有一定的敏感性，但约70% ～ 80%的肿瘤会复发并对治疗产生耐药性［9］。对化疗药物的耐药性可分为两大类，内源性和获得性耐药性。在内源性耐药中，耐药相关因素在未接触任何药物之前就存在于肿瘤细胞中［10］，而获得性耐药或多重耐药是一个缓慢而逐步的过程，迫使肿瘤细胞在治疗期间发生基因突变或表观遗传变化，从而导致耐药［11］。获得性耐药可归因于化疗药物的细胞内浓度降低、癌基因或抑癌基因表达改变、DNA损伤修复增强、上皮间质转化、自噬和高酸性TME［12］。最近，越来越多的研究强调了外泌体在诱导肿瘤化疗耐药中的重要作用。

1.1 外泌体介导的药物流出

肿瘤细胞降低化疗药物药效的机制之一是通过外泌体携带化疗药物排出细胞外从而抑制这些药物及其代谢物的作用。化疗药物被细胞转运排出，导致细胞内药物浓度下降，被认为是化疗耐药的主要原因［13］。例如，在前列腺癌中，与相应的化疗敏感细胞相比，恩杂鲁胺 （enzalutamide，ENZ） 耐药细胞释放的外泌体数量显著增加（2 ～ 3倍），这些耐药细胞通过外泌体将ENZ从细胞中排出以减少细胞内药物浓度［14］。此外还有一项研究表明用紫杉醇或多柔比星作用于乳腺癌和卵巢癌细胞系可呈时间和剂量依赖性显著增加外泌体的释放，从这些细胞中分离出的外泌体含有相当浓度的药物，对受体细胞具有明显的细胞毒性作用［15］。类似地，细胞外酸化可以加速黑色素瘤细胞通过外泌体直接排除顺铂类药物，从而促进了黑色素瘤细胞对顺铂的耐药性，但质子泵抑制剂在一定程度上逆转了黑色素瘤细胞的化疗耐药性［16］。

1.2 外泌体调节肝癌干细胞特性

肝癌干细胞（liver cancer stem cell，LCSC）是一种具有强大自我更新、分化和肿瘤发生能力的肝癌细胞亚群。LCSC相关基因，包括上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和CD133在索拉非尼耐药细胞中高度表达。 EpCAM+细胞大量表达钙黏素4，一种染色质重塑酶，并影响 PPAR 和DNA双链断裂修复以增强 HCC 细胞的耐药性［17］。目前，CD133已成为LCSCs研究的焦点，HCC 组织中的CD133表达是HCC患者生存和肿瘤复发的独立预后因素。与CD133-HCC细胞相比，CD133+HCC细胞具有显著的顺铂耐药性，并且miR-124的过表达通过靶向SIRT1/ROS/JNK引起顺铂诱导的针对CD133+HCC细胞的细胞毒性的敏感性［18］。CD133+HCC 细胞还可以通过激活 AKT/PKB通路，赋予对阿霉素和5-氟尿嘧啶 （5-fluorouracil，5-FU） 的耐药性［19］。因此，LCSC特性被认为是导致HCC耐药性的关键因素。

在一项体外研究中，将富含lincRNA-ROR（linc-ROR）的外泌体与CD133+LCSC共孵育，减少了索拉非尼或阿霉素诱导的HCC细胞死亡。而敲除linc-ROR增强了化疗诱导的细胞凋亡和细胞毒性，表明了外泌体lncRNA在LCSC诱导的化疗耐药中的重要性［20］。然而，已经有研究发现肝癌细胞分泌的外泌体中的p120-连环蛋白抑制HCC细胞增殖和转移以及LCSCs的扩增［21］。综上所述，不同干细胞群分泌的外泌体在肿瘤的进展中发挥不同的功能。外泌体对LCSC介导的HCC细胞耐药性的影响是复杂的，应在各种条件下进一步验证。

1.3 TME中的外泌体对HCC耐药的影响

TME是一个复杂的生态系统，是肿瘤发生和发展各个阶段的积极参与者［22］。TME包含瘤上皮和各种肿瘤支持细胞，如免疫细胞、成纤维细胞、免疫抑制细胞、脂肪细胞、内皮细胞和各种细胞因子［23］。外泌体在肿瘤细胞和构成TME的周围细胞之间充当有效的信号分子，在肿瘤耐药的发生中起到至关重要的作用。

巨噬细胞能够分泌出促进肿瘤生长的外泌体。最近的一项实验验证了巨噬细胞衍生的外泌体增强糖酵解，介导肺癌细胞对顺铂化疗的耐药性。分子通路研究表明，这些外泌体具有高水平的miRNA-3679-5p并降低NEDD4L的表达以促进c-Myc的稳定性，从而促进肺癌的生长，并增强了糖酵解和顺铂的耐药性［24］。TME中缺氧会导致巨噬细胞分泌含有高水平miRNA-223的外泌体作为肿瘤促进因子。通过外泌体传递miRNA-223 降低磷酸酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue，PTEN）表达以诱导 PI3K/AKT 信号通路介导的细胞耐药［25］。基质细胞还有助于环境酸化，为肿瘤的生长创造有利的TME。酸性微环境触发缺氧诱导因子 1/2α（hypoxia inducible factor-1/2α，HIF-1/2α）的激活并刺激外泌体miR-21和miR-10b的表达，从而显著促进HCC 细胞在体内和体外的增殖、迁移和侵袭［26］。肿瘤来源的外泌体参与了成纤维细胞向癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast，CAF）的分化，从而促进了肿瘤耐药性的发生。例如，从HCC细胞中分离的外泌体表现出将正常肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）转化为CAF的强大能力，因为外泌体miR-21直接靶向PTEN，导致HSC中PDK1/AKT信号通路的激活。此外，活化的CAF通过分泌血管生成细胞因子（包括 VEGF、MMP2、MMP9 和 TGF-β）进一步促进肿瘤进展［27］。CAF 分泌的外泌体也会促使肿瘤细胞产生耐药性。顺铂和紫杉醇通过激活泛素特异性蛋白酶 7/异质核核糖核蛋白A1轴促进CAF分泌miR-522，从而抑制手性脂氧合酶15并减少癌细胞中脂质过氧化物的积累，最终导致化疗敏感性降低［28］。在HCC细胞中，外泌体作为信息载体，介导TME中各种细胞类型之间的通讯，从而导致耐药性的获得［29］。

2 外泌体作为预测HCC治疗敏感度的生物标志物

在血浆或血清中发现的外泌体不仅来自血细胞，还来自全身组织。这表明外泌体可能会作为监测肿瘤耐药性的循环生物标志物［30］。几种 miRNA 已被证明可用作 HCC 预后的预测性生物标志物。最近的研究表明，miR-92a、miR-221、miR-487a 或 miR-1468 的高表达与HCC患者的不良预后相关［31-34］。相反，miR-33a、miR-137、miR-194 或 miR-940 的下调导致 HCC的不良预后［35-37］。靶向 PTEN 的外泌体 miR-32-5p 的高表达表明 HCC 患者预后不良［38］。外泌体 miR-93 和 miRNA-665 的过表达在HCC患者中均显示出较短的存活时间，这表明血清外泌体miRNA 既可用于诊断，也可作为肝癌预后的独立指标。由于血液中外泌体 miRNA 的稳定存在，外泌体诊断标志物甚至比经典的血清标志物甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP） 具有优势。多项研究证实，外泌体 miR-125b［39］、 miR-9-3p［40］、和 miR-10b-5p 对HCC患者诊断的敏感性和特异性明显优于常规血清 AFP［41］。

外泌体也在其他肿瘤中显示出了作为预测治疗敏感度的生物标志物的潜力。例如，循环外泌体中miRNA的表达程度与铂类耐药和卵巢癌的复发有关［42］。miR-891a-5p在复发性卵巢癌患者中高表达，而在未复发的患者中则低表达。转染miR-891a-5p的上皮性卵巢癌细胞增加了参与DNA修复机制的G2/M检查点蛋白的表达，这可能与顺铂耐药性和高复发风险有关［43］。顺铂耐药卵巢癌患者血清外泌体中circRNA Foxp1表达上调，而circRNA Cdr1as表达下调［44］。在铂类耐药卵巢癌细胞中，外泌体pGSN表达显著增加已被认为是化疗耐药的生物标志物［45］。

综上所述，外泌体作为“液体活检”的重要组成部分，揭示了外泌体在耐药机制中的潜在作用，在肿瘤的精准诊断和治疗中具有广阔的应用前景。外泌体是大分子物质的载体，在机体细胞的信息交换和信号转导过程中发挥着重要的生理作用。外泌体具有稳定性高、含量丰富、无创性和快速检测等优点，有望成为新型循环生物标志物，具有潜在的临床疾病辅助诊断应用价值。

3 外泌体作为逆转HCC耐药性的新型治疗手段

外泌体作为细胞间蛋白质和核酸的天然载体，它们能够穿过脂质双层分子膜结构，有相当多的研究表明外泌体可以有效传递药物或基因。例如，将阿霉素通过电穿孔的方式装载到外泌体中能够更迅速地在乳腺癌细胞中进行药物的吸收和分布［46］。负载miRNA-126的外泌体调节PTEN/PI3K/AKT信号通路，从而减少人非小细胞肺癌细胞系A549细胞的增殖和迁移［47］。此外，将外泌体表面的CD47激活后可以使外泌体避免单核巨噬细胞系统的吞噬作用，使得装载Erastin的CD47+外泌体在肝癌组织中的分布效率更高，在体外和体内都可以强烈诱导肝癌细胞的铁死亡［48］。外泌体作为人体的天然产物，与其他用于药物或基因递送的合成纳米载体相比具有许多优势，例如低免疫原性、高生物相容性和高递送效率［49］。此外，外泌体在循环系统中具有良好的稳定性，这使它们能够在体内长距离行进，并在生理和病理条件下将它们的货物运送到靶细胞。外泌体具有类似胞质溶胶的核心，这使其成为水溶性药物的合适载体［50］。例如，通过电穿孔从载有 5-FU和 miR-21i 的供体细胞中纯化工程化外泌体，将其引入抗 5-FU 的结直肠癌细胞系 HCT-116/5FR，与 miR-21i 或 5-FU 的单一治疗相比，miR-21i 和 5-FU 与工程外泌体的组合递送有效地逆转了耐药性并显著增强了 5-FU 对癌细胞的细胞毒性［51］。将顺铂转移到外泌体中，亦显著提高了顺铂在人卵巢癌细胞顺铂耐药株A2780/DDP细胞中的细胞毒作用［52］。这些天然纳米颗粒被广泛用作常规药物、基因和其他天然化合物的递送系统。

除此之外，通过抑制外泌体的生物发生来维持细胞内药物浓度或从外泌体内输出诱导耐药性物质也是未来逆转肝癌化疗耐药的新目标。尽管在HCC方面的相关研究较少，但在其他几种癌症类型中进行了研究。例如，B细胞淋巴瘤分泌的CD20+外泌体，可以作为利妥昔单抗的靶点，CD20+外泌体通过抗原抗体结合的方式，大量消耗了游离利妥昔单抗的数量，减少了有效到达肿瘤细胞的药物分子的数量。相反，通过吲哚美辛阻断外泌体的生物生成，恢复了治疗益处［53］。脂肪细胞外泌体中的甘油三酯转移蛋白（microsomal triglyceride transfer protein，MTTP）表达增加，可作为铁死亡的抑制剂，降低了结直肠癌细胞铁死亡的敏感性，从而促进了对奥沙利铂的耐药性。相反，靶向分泌型 MTTP 的治疗可能会逆转结直肠癌细胞中奥沙利铂耐药性。证明MTTP的抑制增加了对化疗的敏感性［54］。外泌体的靶向治疗可能是逆转HCC耐药性的新方案。

4 总 结

随着医疗技术的发展，HCC在诊断、治疗方面已取得了显著的进步，但仍需进一步明确肿瘤的发生发展机制。目前HCC治疗的有效手段是化疗，但HCC对化疗药物产生的耐药性是目前面临的一个主要障碍，需要找到化疗耐药的根源，更好地解决化疗耐药这一难题。外泌体作为生物活性成分，将蛋白质、脂质、DNA、mRNA、ncRNA等物质从供体细胞转移到受体细胞，在HCC的耐药、监测、转移和治疗中发挥着关键的作用，为临床治疗HCC提供了新思路。尽管尚未完全明确耐药相关机制，但外泌体在肿瘤的化疗耐药中的研究已取得了一定成果。在今后的研究中，明确HCC耐药过程中外泌体介导的具体分子机制变得尤其重要，可为靶向治疗及利用外泌体的新型治疗提供重要的理论依据。希望研究人员能够深入研究这一新兴领域，并设计出基于外泌体的策略来克服肿瘤治疗中的耐药性，这将是肿瘤治疗中最具前景和最具挑战性的问题。

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