基于16S rDNA高通量测序研究电针对腹泻型肠易激综合征大鼠肠道菌群的调节作用

王婧雯 郑淑霞 林晟 许金森

腹泻型肠易激综合征(irritable bowel syndrome-diarrhea,IBS-D)是一种反复发作、缠绵不愈的慢性功能性肠病,其在临床上的特征主要是腹泻、腹痛或腹部不适,根治较难。目前了解到的发病机制有胃肠功能紊乱、脑肠轴紊乱、内脏高敏感性、肠道菌群失调等。有研究发现,肠道菌群失调与IBS-D的发生发展关系密切,IBS-D患者的肠道菌群与正常人相比存在明显差异,常表现为有益菌减少,有害菌增多[1]。临床在治疗IBS-D时采取了很多方法,然而效果却不尽如人意,针灸以其安全有效简便的优点在众多治疗方法中崭露头角。近几年的研究发现,电针不仅可以改善IBS-D患者的各项症状[2],降低内脏高敏感性[3-4],而且对于改变肠道菌群结构也有一定帮助[5],但是对于其中具体的分子机制仍存在疑惑。课题组前期研究已经表明电针对于IBS-D大鼠具有良好的治疗效果,能够缓解大鼠症状,且对于辣椒素受体(TRPV1)以及蛋白酶激活受体-2(partition defective protein-2,PAR-2)通路有影响,但具体对大鼠肠道菌群的影响没有做出研究,故本研究拟在前期研究基础上,从肠道菌群角度探讨电针足三里治疗IBS-D的机制。

1 材料与方法

1.1动物

选用体质量为(200±20)g雄性SPF级SD大鼠25只,由杭州医学院提供[许可证号:SCXK(浙)2019-0002],于福建省中医药科学院实验动物中心饲养。饲养条件:室温26℃左右,湿度60%左右,自由饮食,适应性喂养一周后开始实验。本实验严格按照《实验动物管理条例》等文件要求进行。

1.2仪器、设备

R407型小动物呼吸麻醉机(深圳瑞沃德生命科技公司)、电针仪(华佗牌SDZ-Ⅱ型)、0.25×13 mm的毫针(北京汉医医疗器械有限公司)。

1.3实验药品和试剂

番泻叶饮片(豪州市华鑫中药饮片科技有限公司)、异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)、0.9 %氯化钠注射液(江西科伦药业有限公司)。

1.4动物分组及处理

按照随机数字表法将大鼠分为正常组8只、模型组8只、电针组9只。正常组不做处理,正常饮水进食;模型组和电针组进行为期两周的造模后,对电针组做电针干预处理,模型组做同等抓取,不做电针处理。

1.5模型制备

采用慢性束缚应激联合番泻叶灌服法进行造模[6-7],具体操作方法:动物实验前10小时禁食不禁水,先给予番泻叶煎剂(0.3 g/mL)灌胃给药(10 mL/kg),每日1次,连续灌胃14天。灌服完番泻叶煎剂后,即用自制铁丝网将大鼠固定1小时,期间限制大鼠活动,每日1次,持续14天。

1.6干预方法

造模结束后,电针组选择双侧“足三里”穴进行针刺干预。参照《实验动物针灸穴位图谱》进行定位,选取位于膝关节后外侧,腓骨小头下约5 mm处的“足三里”穴。具体方法:采用自制固定器固定大鼠,暴露大鼠足三里的穴区,用0.25 mm×13 mm毫针直刺,深度5 mm,进针后不需要进行手法刺激,连接电针仪进行治疗,设置连续波[8],频率2 Hz,电压2～5 V,强度以大鼠不嘶叫为宜,电针20分钟,左右足三里交替进行,每日1次,连续5天。

1.7内脏敏感性检测

检测前,大鼠禁食不禁水18小时,给予异氟烷麻醉各组大鼠后,用自制工具(三通管连接自制球囊、血压计、针筒)进行检测。在球囊上涂充足的液体石蜡后将球囊缓慢插入大鼠肛门约4.5 cm处,然后把大鼠放进自制的20 cm×8 cm×8 cm大小的亚克力透明盒中。等待大鼠完全清醒后,约30分钟左右检测大鼠的内脏敏感性。测量腹壁回撤反射评分(abdominal withdrawa reflex,AWR)时由针筒向球囊内注入空气,使血压计读数短时间内分别达到20、40、60、80 mmHg。不同容积的压力每个持续20秒,重复3次。

AWR评分标准[9]:0分,无明显行为变化;1分,大鼠身体不动或仅有简单的头部运动;2分,大鼠腹部肌肉开始收缩;3分,大鼠下腹壁抬离地面或明显收缩变平;4分,大鼠腹壁拱起或伴身体、骨盆躬起,臀部抬离地面。

1.8样本采集与指标检测

干预结束后,大鼠禁食不禁水18小时,用高温烘烤过的手术器械进行操作。先将大鼠放入小动物呼吸麻醉机诱导盒中使其吸入异氟烷后至麻醉状态,接着于冰上迅速剪开大鼠的结肠组织,将留存在大鼠肠道内的粪便取出1到2颗装入备好的无酶EP管内,随后置于液氮中保存。

实验结束后,将取材得到的大鼠粪便采用16S rDNA高通量测序技术进行肠道菌群的检测由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。基本流程:从样品中提取总基因组DNA,进行16SrDNA区段扩增,PCR产品定量和鉴定,混合和纯化PCR产物,使用无链®DNA PCR 样品制备法生成测序文库,测序结果最终进行生物信息分析。

测序完成后,对测序得到的原始数据进行处理,随后基于有效数据进行OTUs 聚类。根据 OTUs 聚类结果,先做物种注释,接着进行Beta多样性分析,比较样本群落组成的相似性或差异性。粪便基因测序以及生物信息分析流程由北京博奥晶典生物技术有限公司提供,根据公司平台生成的数据和图片进行统计分析处理。

1.9统计学处理

2 结果

2.1内脏敏感性检测结果

由表1可以看出,与空白组相比,模型组大鼠腹壁回撤反射评分明显升高(P<0.05),提示造模成功。经过电针治疗后,与模型组相比,在20 mmHg的压力下,电针组腹壁回撤反射评分明显降低(P<0.05),而在更大压力下的变化并不明显,说明电针可以有效改善IBS-D大鼠的内脏敏感性,对于更大压力变化不明显的原因有待进一步探索。

表1 三组大鼠电针后不同压力下腹壁回撤反射评分结果

2.2OTU分类韦恩图

通过三组样本的OTU分布,对样本的物种分布情况初步判断,如图1所示,空白组OTU个数共有2106,模型组共有1739个,电针组共有2047个OTU数目;其中模型组与空白组相交叠的OTU数目明显低于电针组与空白组交叠数目。说明经过治疗后,电针组总OTU数目以及与空白组交叠数目均有所上升。

注:K:空白组;M:模型组;D:电针组。

2.3大鼠粪便菌群测序量分析

Shannon稀释曲线可以用来反应各样本在不同测序数量时的微生物多样性,如图2所示,各组大鼠OTUs不会随着测序量增加而上升,曲线趋于平坦,说明可以反应该样本绝大多数微生物多样性信息,足够可靠。

图2 三组大鼠粪便菌群测序量分析Shannon-Wiener图

2.4大鼠粪便菌群物种组成分析

根据OTU聚类结果,分别在纲、属、种水平上发现,三组的肠道菌群群落结构基本相似,只是构成比有差异。通过比较三组大鼠的菌群物种分布情况,说明电针治疗可以改善菌群结构。

在纲(class)水平上,拟杆菌纲、梭菌纲、芽孢杆菌纲、δ-变形杆菌纲四种菌纲丰度相对较高。与空白组相比,模型组拟杆菌纲、梭菌纲、δ-变形杆菌纲等均有升高,芽孢杆菌纲则明显降低。而电针组的菌群结构则在模型组的基础上有所变化。如图3A所示。

注:K:空白组;M:模型组;D:电针组。

在属(genus)水平上,三组中排在前六位的菌属主要有乳杆菌属、lachnospiraceae_nk4a136_group(毛螺菌属)、普雷沃氏菌 Ga6A1属、Eubacterium_coprostanoligenes_group(真杆菌属)、Ruminiclostridium_9、Ruminococcaceae_UCG.014等。与空白组相比,模型组乳杆菌属、真杆菌属明显降低,毛螺菌属、普雷沃氏菌 Ga6A1属、Ruminiclostridium_9、Ruminococcaceae_UCG.014(瘤胃菌属)等明显升高。经过电针治疗后,可看出以上菌属丰度均有一定的改善。如图3B所示。

在种(species)水平上,模型组的菌种结构分布与空白组存在明显差异,其中约氏乳杆菌的占比明显减少,而隶属于灰色部分的其他菌种的占比明显增加,经过电针治疗后有所改善。如图3C所示。

2.5大鼠粪便菌群多样性比较

Beta多样性分析用来比较不同样本在物种多样性方面的相似程度。采用bray curtis的算法计算样本间的距离,得到主坐标(PCoA)分析的结果,从图4可看出模型组与空白组明显被区分开(P<0.05),电针组则在两组之间;且模型组、空白组的组内集群效果好,电针组较差。说明了电针组样本在向空白组靠近,电针可以改善IBS-D大鼠模型的Beta多样性。

图4 基于bray curites距离的PCoA分析

3 讨论

依照自然属性分类,人体常见的几大细菌门主要为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门等,大多数人肠道菌群中百分之九十九由这四种菌门组成,它们的丰度和构成比例对人们的健康影响极大[10]。有研究表明IBS-D患者肠道菌群结构与健康人相比存在失调情况[11-12],其肠道微生物在粪菌移植治疗后,会出现菌群丰度增加、结构改变的情况[13]。近几年,很多学者将肠道菌群作为治疗IBS-D的靶点,得到了较好的效果。IBS-D患者的肠道微生物失调总结起来就是有害菌增加、有益菌减少[14],那么了解哪些有害菌增加,以及又有哪些有益菌减少是非常有必要的。目前,大多研究都认为,厚壁菌纲、拟杆菌门等丰度增加,乳杆菌属、双歧杆菌等丰度降低会引起IBS-D[15-17]。众所周知,IBS-D患者的典型症状主要是腹痛、腹泻、腹胀等,这与内脏高敏感性相关[18],曾有学者提出其腹痛症状与肠道菌群结构关系密切,在于肠道菌群会产生能加重腹痛症状的乙酸盐[19];同时,也有人指出腹泻症状与某些菌群密切相关, 可能是因为一些肠道菌群能够产生影响肠道渗透性的脂多糖[20]。因此,通过改善肠道菌群结构紊乱的情况,可以缓解IBS-D的症状。

本实验通过慢性束缚应激联合番泻叶灌服法构建IBS-D大鼠模型,实验结果证明电针足三里可以通过改善大鼠肠道菌群结构达到治疗大鼠的目的。通过分析各组大鼠粪便菌群在不同水平上的物种组成的结果发现,IBS-D大鼠粪便菌群的物种构成与空白组大鼠存在明显差异,这与其他人的研究结果一致[21-22]。本研究发现,乳杆菌属明显降低,且其中约氏乳杆菌种下降非常明显,乳杆菌属做为有益菌,可以对抗机体致病微生物,改善肠道屏障功能,预防和治疗腹泻。此外,本研究还发现模型组的普雷沃氏菌 Ga6A1属丰度明显高于其他两组,Prevotellaceae_Ga6A1_group隶属于普氏菌属,普雷沃氏菌可以加快碳水化合物发酵,诱发内脏超敏反应,甚至可能通过增加肠道通透性的方式加剧腹痛腹泻的症状。基于此,普雷沃氏菌的增加与内脏高敏感性呈正相关。因此,乳杆菌属的降低、普雷沃氏菌的增加都可能是IBS-D的起病原因。

本实验通过电针足三里穴发现,IBS-D大鼠具有内脏高敏的反应,且证实了其具体的内在机制可能与肠道菌群结构有关;明显可以看出模型组相较空白组而言有降低或增加的肠道微生物,在电针组中或多或少得到了改善。本研究证明了高通量测序技术可以满足大鼠肠道菌群的检测需求,为深入研究电针足三里穴治疗IBS-D提供了参考思路,但由于受客观条件的影响,并未对实验中改变明显的菌群进行功能预测,未来可进一步研究菌群的功能基因在代谢途径和蛋白功能上的差异和变化。