巴戟天寡糖对绝经后骨质疏松大鼠血清骨转化指标和骨组织结构的影响及其机制研究

庄文德 陈浩谚 陈振 肖增林 钟诚 郭浩华 晋大祥 丁平 谢炜星

骨质疏松症是一种常发于中老年人群的系统性代谢性骨骼疾病,以骨骼质量下降,骨微结构破坏,易发骨折为主要特征[1]。我国流行病学调查显示65岁以上人群中32%的人群患有骨质疏松症,其中女性患者占51.6%,绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis,PMOP)广泛困扰着中老年女性人群。巴戟天具有温补肾阳,强壮筋骨的功用。现代药理学研究表明, 巴戟天具有抗骨质疏松、抗炎镇痛、抗衰老、抗氧化等作用[2]。既往研究表明巴戟天能够升高骨质疏松大鼠血清中骨保护素(osteoprotegerin,OPG)水平,同时降低核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)表达水平,调节OPG/RANKL信号轴维持骨稳态,调节破骨细胞,具有防治骨质疏松的作用[3-5]。然而,巴戟天中抗骨质疏松作用的有效成分仍不明确。巴戟天寡糖作为巴戟天主要的药效成分之一,其含量可占巴戟天药材干质量的10%以上[6],具有抗抑郁、抗痴呆、保护神经细胞、改善生育等多种药理作用[7]。但关于巴戟天寡糖对PMOP的防治作用目前尚未见报道。因此,本实验观察并比较巴戟天寡糖对PMOP模型大鼠的血清骨代谢标志物、骨微结构及骨组织结构参数的影响,初步探究其抗骨质疏松潜在机制,以期为巴戟天寡糖的临床应用及新药开发提供科学依据。

1 材料和方法

1.1实验动物

采用3月龄SPF级雌性SD大鼠50只,体质量220～260 g,来源:广州中医药大学实验动物中心[许可证号:SYXK(粤)2018-0085]。所有大鼠均在动物房中饲养,保持大鼠生活环境的清洁、通风,12小时的光/暗周期,温度(24±2)℃,自由获取饲料和饮水。各组大鼠均存活,无一死亡,最终各组纳入大鼠均为10只。此次实验在广州中医药大学实验动物伦理委员会的批准及监督下进行。

1.2实验药物

本研究中实验药物为巴戟天寡糖,由广州中医药大学中药学院丁平教授制作提供。

1.3主要试剂及仪器

阿仑膦酸钠(上海麦克林有限公司,批号:C10663728);大鼠骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BALP)、Ⅰ型胶原氨基端延长肽(procollagen type 1 N-terminal propeptide,P1NP)、Ⅰ型胶原交联羧基末端肽(C-terminal telopeptide of type 1 collagen,CTX-1)、抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate resistant acid phosphatase-5b,TRACP-5b)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自江苏酶免实业有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,货号:P0012;OPG、RANKL antibody购自南京巴傲得生物科技有限公司,货号:BS6684、BS72037;组织RNA提取试剂盒(Tissue RNA Purification Kit PLUS)、RNA逆转录试剂盒(Color Reverse Transcription Kit)、RNA扩增试剂盒(2×Color SYBR Green qPCR Master Mix)购自美国ZSCIENCE生物科技有限公司;SignalBoostTM免疫信号增强剂购自默克生命科学技术(南通)有限公司,货号: 407207等。

双能X射线骨密度仪(Bruker科技有限公司);1510全波长酶标仪(赛默飞世尔科技公司);电泳仪、梯度PCR仪(美国 Bio-Rad 公司);全自动化学发光仪(上海天能生命科学有限公司);微计算机断层扫描仪(Bruker SkyScan 1276) ;生物力学试验机S1083 (德国Lloyd Instruments公司);骨组织形态计量学测量软件(美国KSS Scientific Consultants公司) 。

1.4动物分组与造模

实验动物随机分为5组:假手术组、模型组、阿仑膦酸钠组、巴戟天寡糖低剂量组、巴戟天寡糖高剂量组,每组10只。PMOP大鼠模型造模手术参考文献[8]方法,将3%戊巴比妥钠按照3 mg/kg的比例注射入腹腔进行麻醉,备皮,消毒铺巾,取俯卧位于大鼠背部正中线旁开1.5 cm,双侧肋缘下1 cm处作1～1.5 cm手术切口,从腹腔中提出乳白色脂肪团,轻柔翻转找到卵巢,结扎其双侧输卵管和血管,将卵巢摘除,将伤口逐层缝合;假手术组采用同样方法,但不摘除卵巢及其双侧输卵管和血管,仅清除周围脂肪。术后均肌注青霉素(8万单位/天,共3天)。术后12周用双能X线骨密度仪测定骨密度,确保除假手术组外的4组大鼠已成功构建PMOP大鼠模型。

1.5给药处理

分别给予假手术组、模型组蒸馏水(10 mL/kg);阿仑膦酸钠组(7 mg/kg),每周将阿仑膦酸钠用纯水配置0.7 mg/mL灌胃;巴戟天寡糖低剂量组(25 mg/kg)、巴戟天寡糖高剂量组(75 mg/kg),每天将巴戟天寡糖用纯水配置2.5 mg/mL、7.5 mg/mL灌胃,连续给药12周。

1.6骨代谢标志物含量检测

连续给药12周结束后,予大鼠禁食不禁饮24小时,麻醉下开腹,腹主动脉采血3～4 mL至离心管静置1小时,1500 r/分钟离心取上层血清;根据ELISA试剂盒的操作说明书检测各组大鼠采样血清中BALP、P1NP、TRACP-5b、CTX-1等指标的含量变化。

1.7骨生物力学的测定

抽取血清样本后,取出各组大鼠腰椎骨、胫骨、股骨,剔除软组织,灭菌后-80℃保存,以用于骨骼相关指标的检测。用游标卡尺测量各组大鼠左侧股骨的长度、短轴宽度和长轴宽度,用生物力学试验机进行三点弯曲检测,测定骨骼的最大载荷、最大挠度、最大应力、最大应变和能量吸收值。

1.8骨密度及骨微结构动态、静态参数的检测

骨密度指标采用骨密度仪测定各组大鼠腰椎骨标本的骨密度。取出各组剩余的大鼠右侧股骨远端,用4%多聚甲醛固定后保存于4℃冰箱。经过3天的保存,再使用生理盐水浸泡1天,用微计算机断层扫描仪(micro computed tomography,Micro-CT)扫描各组大鼠股骨远端,Micro-CT扫描参数电流100 μA,电压80 kV,扫描厚度15 μm,滤片精度0.5 mm,像素分辨率1000×666,扫描方向沿股骨长轴扫描,最终获取连续平面Micro-CT图像,扫描完成后在主机上选出股骨远端1.5 mm的区域为感兴趣区域(range of interests,ROI),并通过配套软件“CTan”分析各组大鼠股骨远端骨组织静态参数。取各组大鼠剩余的股骨组织暴露骨髓腔,进行固定、脱水、包埋,制成8 μm 骨厚片封片测量相关动态参数,然后按公式计算出相应的动态参数。

1.9OPG、RANKL mRNA和蛋白表达水平的检测

将低温保存的剩余大鼠骨组织研磨成粉末,根据试剂盒操作说明书进行RNA提取,按照Color Reverse Transcription Kit及2×Color SYBR Green qPCR Master Mix说明书进行RNA逆转录。引物来自上海生工生物工程有限公司。反应体系:2×Color SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL,cDNA 2 μL,加ddH2O至20 μL。95℃ 5分钟1次,95℃ 10分钟,60℃ 30秒,循环39次;溶解曲线:95℃ 10秒,65℃ 5秒。以GAPDH为内参基因,以2-ΔΔCt计算对应各组骨组织中OPG、RANKL mRNA相对表达量。具体引物序列见表1。

表1 引物序列

另取1 g骨组织粉末加入RIPA蛋白裂解液中提取骨组织总蛋白。对于蛋白定量的测定则使用BCA蛋白检测试剂盒进行操作。蛋白上清与上样缓冲液进行均匀混合后加热至98℃使其变性。使用SDS-PAGE电泳技术分离总蛋白,将总蛋白移至聚偏二氟乙烯膜。膜浸泡于5%脱脂牛奶封闭2小时,分别与一抗OPG、RANKL、β-actin(1∶1000)室温下孵育2小时,并于4℃冰箱过夜。然后,清洗后加入二抗,室温孵育1小时。条带用电化学发光液显影,并用全自动化学发光仪拍照,用ImageJ软件检测和分析所有蛋白条带灰度。

1.10统计学分析

2 结果

2.1巴戟天寡糖对大鼠血清骨代谢指标的影响

与假手术组相比,模型组大鼠血清中BALP、P1NP水平显著下降,CTX-1、TRACP-5b水平显著上升(P<0.05);与模型组相比,阿仑膦酸钠组、巴戟天寡糖低剂量组、巴戟天寡糖高剂量组大鼠血清中BALP、P1NP水平显著上升,CTX-1、TRACP-5b水平显著下降(P<0.05);与阿仑膦酸钠组相比,巴戟天寡糖低剂量组大鼠血清中BALP、P1NP水平降低,CTX-1、TRACP-5b水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),且巴戟天寡糖高剂量组大鼠血清中BALP、P1NP水平较高,CTX-1、TRACP-5b水平较低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组POMP大鼠血清BALP、P1NP、CTX-1、TRACP-5b含量的比较

2.2巴戟天寡糖对大鼠骨密度的影响

与假手术组相比,模型组大鼠的腰椎骨骨密度明显减小(P<0.05);与模型组相比,阿仑膦酸钠组、巴戟天寡糖低剂量组、巴戟天寡糖高剂量组的腰椎骨密度值明显增加(P<0.05);与阿仑膦酸钠组相比,巴戟天寡糖低剂量组的腰椎骨密度值较低(P<0.05),巴戟天寡糖高剂量组的腰椎骨密度值较阿仑膦酸钠组更高,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组POMP大鼠腰椎骨骨密度值的比较

2.3巴戟天寡糖对大鼠股骨生物力学性能的影响

与假手术组相比,模型组大鼠股骨的最大载荷、最大应力及最大应变显著降低(P<0.05),最大挠度和断裂所需的能量吸收值下降,但无统计学差异(P>0.05)。与模型组相比,阿仑膦酸钠组大鼠股骨最大载荷、最大应力及最大应变显著增加(P<0.05),但对其余生物力学指标作用不明显;与模型组相比,巴戟天寡糖低剂量组大鼠股骨的最大载荷及最大应变显著提高(P<0.05),巴戟天寡糖高剂量组大鼠股骨的最大载荷、最大应力及最大应变显著提高(P<0.05),其他股骨生物力学性能也有一定改善,但无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组POMP大鼠股骨生物力学性能的比较

2.4巴戟天寡糖对大鼠股骨组织微结构及形态计量学参数的影响

2.4.1 micro-CT扫描下各组大鼠股骨组织微结构的变化情况 与假手术组比较,模型组皮质骨变薄,骨髓腔增大,骨小梁网状结构退化、呈现出明显的骨微结构破坏。与模型组比较,阿仑膦酸钠组、巴戟天寡糖低剂量组、巴戟天寡糖高剂量组皮质骨面积增加,骨髓腔缩小,骨小梁数量、宽度、长度、形态部分恢复,密度和网状结构联结性增加。其中,阿仑膦酸钠组和巴戟天寡糖高剂量组与假手术组的水平基本一致。见图1。

图1 micro-CT扫描下各组中PMOP大鼠股骨组织微结构的比较

2.4.2 各组大鼠股骨组织形态计量学静态和动态参数变化情况 与假手术组相比,模型组大鼠的股骨相对骨体积、骨小梁厚度、骨小梁数量、荧光标记周长百分率、矿化沉积率、骨形成率与骨体积之比明显减少(P<0.05),股骨骨小梁间距、结构模型指数和破骨细胞数目显著升高(P<0.05);与模型组相比,阿仑膦酸钠组、巴戟天寡糖低剂量组、巴戟天寡糖高剂量组的股骨相对骨体积、骨小梁厚度、骨小梁数量、荧光标记周长百分率、矿化沉积率、骨形成率与骨体积之比明显增加(P<0.05),股骨骨小梁间距、结构模型指数和破骨细胞数目显著下降(P<0.05);与阿仑膦酸钠组相比,巴戟天寡糖低剂量组的股骨相对骨体积、骨小梁数量、结构模型指数、荧光标记周长百分率、骨形成率与骨体积之比及矿化沉积率降低(P<0.05),股骨骨小梁间距和破骨细胞数目升高(P<0.05);巴戟天寡糖高剂量组的股骨组织形态计量学静态和动态参数与阿仑膦酸钠组参数数据相比较则无统计学差异(P>0.05)。见表5～6。

表5 各组PMOP大鼠骨微结构静态参数的比较

表6 各组PMOP大鼠骨微结构动态参数的比较

2.5巴戟天寡糖对大鼠骨组织中OPG/RANKL轴mRNA表达的影响

与假手术组相比,模型组大鼠骨组织OPG mRNA表达量显著下降,RANKL mRNA表达量显著上升(P<0.05);与模型组相比,阿仑膦酸钠组、巴戟天寡糖低剂量组、巴戟天寡糖高剂量组大鼠骨组织OPG mRNA表达量显著上升,RANKL mRNA表达量显著下降(P<0.05);与阿仑膦酸钠组相比,巴戟天寡糖低剂量组大鼠骨组织OPG mRNA表达量降低,RANKL mRNA表达量升高(P<0.05), 巴戟天寡糖高剂量组大鼠骨组织OPG mRNA表达量升高,RANKL mRNA表达量降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表7。

表7 各组PMOP大鼠骨组织OPG、RANKL mRNA表达量的比较

2.6巴戟天寡糖对大鼠骨组织中OPG/RANKL轴蛋白表达的影响

与假手术组相比,模型组大鼠骨组织OPG 蛋白表达量显著下降,RANKL蛋白表达量显著上升(P<0.05);与模型组相比,阿仑膦酸钠组、巴戟天寡糖低剂量组、巴戟天寡糖高剂量组大鼠OPG蛋白表达量显著上升, RANKL蛋白表达量显著下降(P<0.05);与阿仑膦酸钠组相比,巴戟天寡糖高剂量组大鼠骨组织OPG蛋白表达量较高,RANKL蛋白表达量较低(P<0.05),与巴戟天寡糖低剂量组比较则无显著性差别(P>0.05)。见图2。

图2 各组PMOP大鼠骨组织中OPG、RANKL蛋白表达量的比较

3 讨论

骨质疏松的病理机制复杂,目前多认为与代谢异常、基因多态性、微循环障碍等因素相关,西医多治以雌激素调节药物、骨吸收抑制剂、骨形成促进药物等,但其长期使用有一定毒副作用[10]。近年来,大量研究发现中药及中药复方具有促骨形成及改善骨代谢的作用,且不良反应少[11]。因此,从中医药资源中挖掘出可长期服用且不良反应少的抗骨质疏松药物极具现实意义。此前,诸多临床经验及现代药理学研究表明,巴戟天具有抗骨质疏松作用,但主要集中于巴戟天全药及巴戟天多糖的抗骨质疏松机制,尚无对巴戟天寡糖改善老年女性绝经后骨质疏松的作用机制进行探讨研究[12-14]。

血清BALP、P1NP、CTX-1、TRACP-5b水平是用于反映成骨细胞和破骨细胞活性变化情况的常用指标[15-16]。张瑶等[17]人使用二仙汤干预PMOP模型大鼠,发现可以改善模型大鼠的骨密度,提高血清P1NP含量,具有抗骨质疏松作用。段硕等[18]观察活血补肾壮骨方对糖皮质激素性骨质疏松型大鼠骨折愈合的影响,发现可以明显升高BALP,降低TRACP、CTX-1,改善骨微结构,促进骨生成。本研究结果表明,PMOP模型大鼠血清骨代谢指标BALP、P1NP含量显著降低,CTX-1、TRACP-5b含量显著上升,提示骨吸收活动水平提高、骨形成减少。经巴戟天寡糖灌胃处理后,模型大鼠的血清骨代谢指标BALP、P1NP含量显著上升,CTX-1、TRACP-5b含量显著下降,这说明巴戟天寡糖具有改善骨代谢指标的作用,能有效抑制骨吸收、促进骨生成,且本研究中选用的骨代谢指标较全面,其结果更具准确性。再者,巴戟天寡糖高剂量的疗效优于低剂量,这初步说明巴戟天寡糖抗骨质疏松作用与其药物浓度梯度可能存在一定相关性,但其具体机制尚不明确。

此外,骨生物力学性能和骨微结构指标的变化能清晰准确地反应骨质疏松状态下骨骼宏观和微观的变化情况,具有重要的参考价值。过往已有研究发现运用巴戟天多糖干预PMOP小鼠模型,结果提示巴戟天多糖能改善模型小鼠骨密度,发挥抗骨质疏松的作用[19-20],但其研究均未对骨生物力学性能和骨微结构进行深入分析,其结果准确度相对有限。故本研究中,除了对PMOP模型大鼠骨密度进行检测外,还对模型大鼠的骨生物力学性能、骨微结构参数进行深入分析,发现运用巴戟天寡糖干预后,PMOP大鼠股骨生物学性能改善明显,骨密度、相对骨体积、骨小梁数量显著升高,骨小梁间距、结构模型指数、破骨细胞数目显著下降,具有统计学意义(P<0.05),且随着浓度梯度增加,增加骨量及改善骨微结构的效果更好,这表明巴戟天寡糖具有较好的抗骨质疏松作用,这与巴戟天多糖作用相似。但巴戟天寡糖还能改善PMOP状态下的骨骼骨微结构动态及静态相关指标,其抗骨质疏松的作用更具可信度。

OPG/RANKL轴调控骨骼组织形成与吸收的相对平衡,是维持骨稳态以防治骨丢失,确保正常骨重建活动的关键调节机制[21]。本研究对于巴戟天寡糖抗骨质疏松作用机制进行了初步探讨,发现PMOP模型大鼠股骨远端骨组织中OPG、RANKL mRNA及蛋白表达水平发生明显改变,OPG表达下调、RANKL表达上升,提示PMOP模型大鼠骨代谢平衡异常与OPG/RANKL信号轴有关。课题组发现,经巴戟天寡糖干预后,无论是高、低浓度组,大鼠OPG蛋白表达量均显著上升,RANKL蛋白表达量均显著下降(P<0.05)。此外,高浓度巴戟天寡糖对OPG/RANKL信号轴的干预效果比阿仑膦酸钠更加明显(P<0.05)。这表明巴戟天寡糖抗骨质疏松作用较好,也提示巴戟天治疗骨质疏松的作用可能与巴戟天寡糖调控OPG/RANKL信号轴相关。

综上所述,巴戟天寡糖能够增加PMOP模型大鼠骨量,改善骨生物学性能及骨微结构,调节大鼠的骨代谢平衡情况,其机制可能与调控OPG/RANKL信号轴相关。但本实验尚存在以下不足:未对巴戟天寡糖浓度梯度变化进行深入研究,且其相关信号通路机制研究仅做了初步探索,需进一步研究。此外,尽管关于巴戟天寡糖治疗骨质疏松的研究较少,但巴戟天寡糖具有副作用少、安全性高的特点,并且已有中成药制剂应用于临床[22],在临床上拥有较好的应用前景,所以课题组也将继续深入研究其发挥抗骨质疏松作用的具体分子机制以及关键靶点,为巴戟天治疗骨质疏松症的临床应用及中药开发提供科学依据和新思路。