线上销售药用猪苓的品质评价*

杨超勍，欧阳建萍，2，邵 君，许春明，孙启彪，2，季晓红，2，何 刚，2**

（1.九江学院药学与生命科学学院，江西 九江 332005；2.九江市真菌资源保育及应用重点实验室，江西 九江 332005）

猪苓多孔菌[Polyporus umbellatus(Pers.)Fr.]又称伞形多孔菌，隶属于担子菌门（Basidiomycota）伞菌纲（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）多孔菌属（Polyporus），主要分布于河北、陕西、四川、云南、吉林、安徽等地，是一种名贵的药用真菌[1]。猪苓多孔菌的干燥菌核（即猪苓菌核）亦称为猪苓、猪屎苓、野猪苓等，是其入药部位，具有利水渗湿之功效，主治小便不利、水肿、淋浊、泄泻、带下等症[2-3]。现代医学研究表明，猪苓化学成分丰富，生物活性多样，具有利尿、护肾、抗肿瘤、调节免疫等药理作用[4-5]。随着猪苓药用价值逐渐受到人们重视，市场对猪苓药材的需求也越来越旺盛。然而，市面所售猪苓质量参差不齐，普通百姓缺乏专业知识难以辨别真伪、评判品质，存在以次充好甚至以假冒真等现象，危害人民群众用药安全。

为了解线上平台所售猪苓品质现状，通过分子鉴定并对7 批线上平台所售猪苓药材的性状、显微特征、薄层色谱、水分、总灰分、酸不溶性灰分和主要成分含量进行分析。旨在为猪苓药材真伪鉴别和品质评价提供科学依据，为合理利用猪苓资源、促进猪苓线上市场健康有序发展提供参考。

1 试验器材

1.1 仪器

UltiMate 3000RSLC 超高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技公司；BX53 生物显微镜，日本奥林巴斯株式会社；BioRad C1000 Touch 梯度PCR 仪，美国伯乐公司；YTH-2.5-10 定时箱式电阻炉，绍兴市苏珀仪器有限公司；AUW120D 分析天平，日本岛津公司；KQ-500TDV 型高频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司； GZX-9030MBE电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；XT-500a 多功能粉碎机，永康市红太阳机电有限公司。

1.2 试剂

麦角甾醇对照品（纯度≥98%），成都普思生物科技股份有限公司；甲醇为色谱纯；石油醚（60～90 ℃，纯度99%）、乙酸乙酯、香草醛、浓盐酸、浓硝酸、浓硫酸等试剂均为分析纯；水为超纯水；真菌基因组DNA 快速抽提试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 材料

试验所用7 批猪苓药材样品均购自线上销售平台，并进行样品鉴定。

2 试验方法

2.1 猪苓的性状和鉴别

参照《中华人民共和国药典（2020年版一部）》[3]中猪苓药材性状与鉴别项下的要求和方法，对其进行外观性状、显微结构和薄层色谱检测。

2.2 猪苓分子鉴定

采用真菌基因组DNA 快速抽提试剂盒，按照说明书提取样品DNA。选用真菌通用引物ITS1 和ITS4 进行扩增，获取猪苓样品ITS 区基因片段[6]。PCR 产物送北京擎科生物科技有限公司测序。

利用Chromas 软件仔细核对所测序列峰图与碱基序列，并在NCBI 网站进行BLAST 比对，以确保所得猪苓序列的准确性。为比较与文献报道的猪苓异同，参考ZHOU 等[7]的研究，从GenBank 数据库下载相关内群和外群序列。运用MEGA 软件将本研究中测得的序列和下载的序列构建序列矩阵，使用MUSCLE 3.8.31 软件对序列矩阵进行比对分析，借助Gblocks v.0.91b 软件删去比对不理想区域或高变区[8]。比对后的序列矩阵基于Akaike Information Criterion 标准，采用MrModeltest 2.0 软件进行最适模型选择，基于最大似然法ML（maximum likelihood，ML）利用RAxML 7.2.8 软件构建分子系统发育关系。根据构建的分子系统发育关系判定市售猪苓样品的系统发育地位。

2.3 水分、总灰分、酸不溶性灰分

参照《中华人民共和国药典（2020年版 一部）》[3]中猪苓检查项下要求和方法，对其水分、总灰分和酸不溶性灰分进行检测。

2.4 麦角甾醇含量测定

参照《中华人民共和国药典（2020年版 一部）》[3]中猪苓检查项下要求和《中华人民共和国药典（2020年版四部）》中通则0512 项下的高效液相色谱法[9]，测定猪苓样品麦角甾醇含量。

2.4.1 色谱条件与系统适应性试验

规格为250 mm×4.6 mm、5 μm 的Symmetry C18色谱柱，流动相为甲醇，检测波长为283 nm，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。理论板数按麦角甾醇峰计算不低于5 000[3]。

2.4.2 对照品溶液的制备

取麦角甾醇对照品适量，精密称定，加入甲醇，制成的麦角甾醇溶液质量浓度为50 μg·mL-1，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备

取样品粉末约0.5 g 过四号筛，精密称定，置于具塞的锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，称定重量，超声（功率为220 W，频率为50 kHz）处理1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足损失的质量，摇匀，过滤，取滤液即得。

2.4.4 测定方法

分别精密吸取20 μL 的对照品溶液与各供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。

3 结果与分析

3.1 猪苓分子鉴定

以购得的猪苓样品基因组DNA 为模板，利用真菌rDNA-ITS 区通用引物ITS1 和ITS4 扩增得到603～644 bp 大小的ITS 序列。所得序列提交至GenBank获得登录号，并在NCBI 中进行同源性搜索，结果显示与多孔菌属（Polyporus）真菌具有高度同源性，故7 批猪苓样品归属于多孔菌属。7 批样品信息详见表1。

表1 线上销售的样品信息Tab.1 Information of online commercial samples

结合表1 中各样品GenBank 登录信息，采用最大似然法将本研究样品测得的ITS 序列与其构建分子系统发育树，详见图1。

图1 基于ITS 序列借助最大似然法构建的系统发育树Fig.1 Molecular phylogenetic tree inferred from ITS sequences using the maximum likelihood method

如图1世纪，样品1 号与KY389212 相似性较高，聚为一支；样品2 号至7 号与KY389217、KY389219、HQ225481、EU442270、AY322495 等系统发育关系更紧密且聚为一支。根据7 批样品分子系统发育关系，进一步确认7 批样品均为猪苓Polyporus umbellatus。

3.2 猪苓性状

猪苓样品的宏观特征、切片特征、粉末性状详见图2～4。

图2 部分线上销售猪苓的宏观特征Fig.2 Macroscopic characteristics of some online commercial Polyporus umbellatus

图3 线上销售猪苓1 号～7 号的切面Fig.3 Section of online commercial Polyporus umbellatus No.1 to No.7

图4 线上销售猪苓1 号～7 号的粉末Fig.4 Powder of online commercial Polyporus umbellatus No.1 to No.7

如图2～4世纪，猪苓原药材呈不规则条形、类圆形或扁块状，少量样品有分枝，长5～15 cm，直径2～5 cm。表面黑色、灰黑色或棕黑色，皱缩或有瘤状突起。猪苓体轻，质硬，断面呈白色或黄白色，略呈颗粒状。气微，味淡。猪苓粉末呈米白色或黄白色。

3.3 猪苓粉末显微特征

显微观察（40×）下猪苓粉末的特征详见图5。

图5 线上销售猪苓粉末的显微特征图Fig.5 Microscopic characteristics from online commercial Polyporus umbellatus powder

如图5世纪，猪苓粉末少数菌丝呈棕色、不易分离；多数菌丝无色，直径为3～8 μm，弯曲，有横隔膜，分枝或呈结节状膨大。有草酸钙方晶，以正方八面体形、规则的双锥八面体形为主，直径为12～56 μm，有时数个结晶集合。

3.4 薄层鉴别

线上销售猪苓样品1 号～7 号薄层色谱图结果见图6。

如图6世纪，在可见光下检视，供试品色谱均在与对照品麦角甾醇色谱相应的位置上，7 个供试样品均在相同位置显示相同颜色斑点。

3.5 水分、总灰分和酸不溶性灰分测定

测定市售猪苓原药材的水分、总灰分、酸不溶灰分，每批样品3 次重复，结果详见表2。

表2 线上销售猪苓中水分、总灰分、酸不溶灰分的测定结果Tab.2 Determination results of moisture,total ash and acidinsoluble ash in online commercial Polyporus umbellatus

由表2 可知，7 批猪苓原药材水分含量除2 号（15.0%）和3 号（14.1%）超过规定范围外，其余样品均为11.1%～13.4%，符合药典规定值（水分≤14.0%）；总灰分含量为2.7%～7.1%，均符合药典规定值（总灰分≤12.0%）；酸不溶性灰分含量为0.3%～1.8%，均符合药典规定值（酸不溶性灰分≤5.0%）。

3.6 麦角甾醇含量测定

麦角甾醇含量测定按照色谱条件进样，样品和标准品色谱图见图7；测定试验重复3 次，市售猪苓原药材麦角甾醇含量测定结果详见表3。

图7 市售猪苓供试品溶液与麦角甾醇对照品的高效液相色谱图Fig.7 HPLC chromatogram of ergosterol standard and test solutions of online commercial Polyporus umbellatus

表3 线上销售猪苓中麦角甾醇的测定结果Tab.3 Determination results of ergosterol in online commercial Polyporus umbellatus

由图7 和表3 可知，麦角甾醇对照品约6 min出峰，重现性好，分离度高，峰型尖锐且无拖尾；7 批猪苓样品中麦角甾醇的含量为0.228 7%～0.346 9%，均符合药典标准（麦角甾醇≥0.070%）。

4 结论与讨论

药用真菌类中药材质量评价主要目的在于鉴别药材真伪优劣，保障人民群众临床用药安全有效。随着猪苓药用范围、来源和市场需求不断扩大，关于猪苓质量评价亦愈发受人们关注。针对猪苓药材质量控制，《中华人民共和国药典（2020年版 一部）》[3]限定了猪苓药材水分、总灰分、酸不溶性灰分和麦角甾醇的含量与性状特征。然而，猪苓药材间宏观形态、微观结构（粉末）近似，传统性状鉴别方法不仅需要专业经验且费时费力，还不能保证精确无误。因此，仅通过外观性状、显微结构和有关含量分析并不能精准反映猪苓药材真伪，难以达到有效质量控制的目的。

为此，本研究中综合利用性状鉴别、分子鉴定、含量测定等方法，对7 批线上平台市售猪苓药材开展性状、显微特征、薄层色谱、麦角甾醇含量、水分、总灰分、酸不溶性灰分等评价。通过形态学观察进行性状鉴别，结合分子系统学和真菌DNA 条形码技术，选取rDNA-ITS 基因片段对市售猪苓药材开展分子鉴定，明确了7 批药材的分类地位，确定均为猪苓。综合形态学和分子鉴定进行药材真伪鉴别，具有快速、准确、可靠等特点，可为此类药材真伪鉴别提供科学依据。

结果显示，7 批猪苓药材水分含量为11.1%～15.0%，除2 号（安徽霍山）和3 号（四川阿坝）水分超标外，其他批号符合《中华人民共和国药典（2020年版 一部）》[3]水分项下规定；而超出水分含量范围的样品可能发生霉变等变质现象从而影响质量。7 批猪苓总灰分含量为2.7%～7.1%，酸不溶性灰分含量为0.3%～1.8%，说明其灰分检测结果符合要求，药材纯度好。参照《中华人民共和国药典（2020年版 四部）》[9]猪苓项下含量测定要求，7 批猪苓麦角甾醇含量为0.228 7%～0.346 9%，其中以产自陕西省佛坪县的猪苓药材含量最高；从含量测定结果看7 批市售猪苓质量符合药典规定。

综上，7 批猪苓药材中除少部分样品水分含量超标，其他各项指标均符合药典标准。建议综合猪苓药材性状要求、分子鉴定、品质指标和含量要求进行猪苓质量控制和评价，以实现药材优质优价。