陕西省大型真菌新记录种——吉林拟鬼伞*

刘 愚，霍文严，贺雪莲，陈 军，张黎光，祁 鹏，戴 璐，李峻志**

（1.陕西省微生物研究所，陕西 西安 710000；2.陕西省太白林业局，陕西 宝鸡 721600）

拟鬼伞属（Coprinopsis）隶属于担子菌门（Basidiomycota）伞菌纲（Agaricomycetes）伞菌目（Agaricales）小脆柄菇科（Psathyrellaceae）[1]。由于其孢子呈暗色，部分种具有菌盖会自溶成黑色的特点，1797年PERSON[2]将此类大型真菌物种从蘑菇属（Agaricus）中分离出来，归为鬼伞属。1994年HOPPLE[3]使用分子生物学手段发现鬼伞属是非单系的。2001年REDHEAD[4]结合分子生物学和形态学特征，证明了HOPPLE 的结论，并将原鬼伞属的物种重新分为4 个新属：鬼伞属（Coprinus）、拟鬼伞属（Coprinopsis）、小鬼伞属（Coprinellus）和近地伞属（Parasola）；其中后3 个属分入小脆柄菇科（Psathyrellaceae）。2020年WÄCHTER 和MELZER[5]对小脆柄菇科进行系统学分析，发现小鬼伞属非单系，又重新分类，建立了刺毛鬼伞属（Tulosesus）和心孢鬼伞属（Narcissea）；将原Coprinellus pakistanicus归入新属Punjabia，这是目前对鬼伞类大型真菌最新的科学分类。

黄柏塬自然保护区地处秦岭南麓，是秦岭自然保护区群的核心区域，与老县城保护区、佛坪自然保护区、长青保护区、牛尾河自然保护区、太白山自然保护区相邻。该保护区是北亚热带和暖温带的过渡地带，地处中国南北植物交汇处，因此，秦岭植被垂直带谱明显，植物区块化明显，容易形成局部的生态和环境圈，生态环境独特[6]。特殊的地理位置与多样的山地垂直带谱，为秦岭大型真菌的生物多样性提供了良好基础[7]。

2021年至2022年，对陕西省内黄柏塬自然保护区的大型真菌生物多样性进行了系统的调查，共采集到大型真菌标本150 余份。通过结合传统的形态学及分子系统学的方法，将编号为20210526 号标本鉴定为吉林拟鬼伞（Coprinopsis jilinensis）。这是首次在陕西省境内发现吉林拟鬼伞，不仅丰富了秦岭地区大型真菌资源的物种多样性，也对秦岭地区的生态环境保护提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

子实体样品（编号20210526），于2021年9月9日采集自太白县黄柏塬自然保护区。干燥标本现保藏于陕西省微生物研究所秦岭菌物标本馆（SXIM）。

1.2 试验方法

1.2.1 形态学观察

在野外采集样本时，对样本的生境、外观形态进行拍照留存，并进行相应的观察记录。内容包括生境特征；菌盖大小、形状、颜色、表面特征；菌褶形状、颜色、宽度；菌肉颜色；菌柄形状、长度、直径、表面特征等；伤变色，是否有乳汁产生等[8]。之后使用干燥变色硅胶处理样品，防止标本发生美拉德反应。显微观察时，先使用5% KOH 溶液对干燥的样品进行复水处理，制作切片，用刚果红染色。使用Olympus BX43 光学显微镜对样品的菌盖、菌丝、菌幕菌丝、孢子、担子等显微结构进行观察，并测量记录菌丝、孢子等的大小[9]。

1.2.2 分子生物学检测

1）DNA 提取。使用生工生物工程股份有限公司的真菌基因组DNA 提取试剂盒，按照说明书提取样本基因组DNA。

2）ITS 序列PCR 扩增。以样本基因组DNA 为模板，以ITS4/ITS5 作为扩增引物，对样本的ITS 序列进行PCR 扩增。扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30次循环；72 ℃延伸6 min。取15 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳（参数为120 V，60 min）检测。

3）将样本的PCR 扩增产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.2.3 生物信息学分析

1）ITS 序列分析。使用DNAMAN 9.0 对测序结果进行人工排除序列误读检查。将检查合格的序列上传至NCBI 中进行BLAST 比对，确认样本的拉丁名。下载与样本相似度高的18 种拟鬼伞属其他物种的碱基序列，用DNAMAN 进行序列比对，对下载的同物种序列进行整理并保存为fasta 文件。

2）系统发育分析。以毛头鬼伞Coprinus comatus（KX015766）作为外类群，用MEGA 7 软件，采用邻接法（neighbor-joining method）以Kimura-2 parameter 模型构建系统发育树，Bootstrap 1 000 次。

2 结果与分析

2.1 形态学分析结果

2.1.1 生境特征

样本于2021年9月采自针阔混交林（以油松和栎类树种为主）。采集地海拔为1 800～2 000 m，散生或群生于林地腐殖土上，与饶固等[10]的描述相似。

2.1.2 宏观结构特征

吉林拟鬼伞子实体的形态特征见图1。

图1 吉林拟鬼伞子实体Fig.1 Fruit body of Coprinopsis jilinensis

如图1世纪，子实体菌盖直径3～7 cm，幼时半球型，成熟后扁半球型，中间稍脐凸，表面浅褐色，被白色短绒毛，有丝状菌膜幕，幼时多，成熟后菌盖边缘有少量残留；菌肉厚，白色；菌褶弯生，宽2 cm，米白色，不等长，波状，边缘锯齿状，紧密；菌柄长3～6 cm，直径1.0～1.5 cm，中生，棒状，由上向下逐渐变粗，基部稍膨大，颜色同菌盖，表面被细绒毛鳞片，肉质，中心海绵质，上端有细纵条纹，基部有白色菌丝体与附着物相连接。

2.1.3 微观结构特征

吉林拟鬼伞的显微结构特征详见图2。

图2 吉林拟鬼伞的显微结构Fig.2 Microscopic features of Coprinopsis jilinensis

如图2世纪，样本担孢子4.3 μm×8.7 μm，杏仁型，孢子壁薄，光滑，淡黄色至黄褐色；担子（3.8～11.5）μm×（29.8～34.5）μm，棒状，无色近透明，壁薄，有2～4 个担子小梗，为无隔担子；菌盖菌丝直径9.1～18.2 μm，无分枝，有横隔，壁薄；囊状体（3.6～8.9）μm×（21.4～33.9）μm，棒状；菌幕菌丝直径13.6～20.5 μm，无分枝，有横隔。

2.2 系统发育分析结果

经测序，编号为20210526 的样品ITS 序列全长为751 bp，系统发育分析结果见图3。

图3 基于ITS 序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

如图3世纪，本次在黄柏塬地区采集到的样本20210526 与之前学者研究的吉林拟鬼伞为同一分支（其序列一致性为100%），支持率100%，并且与拟鬼伞属的其他物种分开。分子系统发育分析结果表明样本20210526 为吉林拟鬼伞Coprinopsis jilinensis。

3 结论

吉林拟鬼伞子的实体小型至中型，不自溶，与鬼伞属和小脆柄菇科的大部分物种不同。只通过宏观形态鉴定，不易分辨。吉林拟鬼伞的命名者饶固等[10]发布并描述了吉林拟鬼伞的生物学特征，该物种最先被发现是在吉林省敦化市，生长在针阔混交林。分子生物学的发展对大型真菌的分类有着关键性的作用，通过分子生物学分析，可以将很多宏观形态学相近的不同物种区分出来，使得分类系统更加完善[3，5]。本试验中通过结合分子手段和宏观特征，确认采集自陕西秦岭地区的样本为吉林拟鬼伞，为陕西省新分布记录种。