皱木耳漆酶生物信息学分析*

李雪松，孙达锋，华 蓉，岳万松，刘春丽，袁绍保，罗孝坤，刘绍雄**

[1.云南云菌（集团）有限公司，云南 昆明 650221；2.陆良爨乡绿圆菇业有限公司，云南 陆良 655601；3.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221]

皱木耳（Auricularia delicata）隶属于真菌界（Kingdom Fungi）担子菌门（Basidiomycota）伞菌纲（Agaricomycetes）木耳目（Auriculariales）木耳科（Auriculariaceae）木耳属（Auricularia），在我国是一种传统的食（药）用菌，具有抗氧化、抗病毒、保肝解毒等功效，常用于治疗各种胃肠道和肝脏疾病[1]。目前，黑木耳（Auricularia heimuer）、毛木耳（Auricularia cornea）等木耳品种已被广泛栽培及推广，但木耳属其他物种的资源开发利用相对较少。与黑木耳、毛木耳相比，皱木耳耳片质地较厚，子实层具有明显的网状褶皱，口感更加松脆爽口[2]。皱木耳的野生资源丰富，主要分布于我国的西南地区，特别是云贵地区。目前，对于皱木耳生物学特性以及生长发育调控基因相关的基础研究较少，这成为了限制皱木耳栽培及推广的因素之一。

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，与抗坏血酸氧化酶、哺乳动物血浆铜蓝蛋白、胆红素氧化酶等同属于蓝色多铜氧化酶家族MCO（multi copper oxidase，MCO）[3]。目前，在细菌、真菌、植物及动物中均有关于漆酶的研究报道。其中，真菌漆酶研究最多，已研究的物种包括杂色云芝（Coriolus versicolor）、糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）、变色栓菌（Trametes versicolor）、灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea）等。真菌漆酶主要参与其形态建成、病原菌致病、色素合成、应激反应等多种生物学过程，对其生长发育十分重要[4-5]。同时，由于漆酶具有广泛的底物作用性，可作为绿色生物催化剂应用于工业、农业、食品、环保、医药等多个领域，具有广阔的市场前景[6]。现有的研究表明，真菌漆酶基因一般包含多个拷贝且通常成簇排列，每一个拷贝的漆酶同源基因可能行使着某一特定的功能，而特定的功能往往与其特有的结构直接相关[7]。因此，对皱木耳漆酶基因的结构展开分析，将有助于了解其生物学功能及作用机制。

本研究对皱木耳的漆酶进行了生物信息学分析，分析了漆酶基因结构、蛋白结构及理化性质。这些结果进一步明确了皱木耳漆酶基因的差异及相关的功能，对阐明皱木耳的生长发育过程、漆酶的开发利用等具有重要意义。同时，通过对皱木耳生长发育过程进行研究，也为规范栽培、优良菌株选育等提供基础支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

从NCBI 数据库中下载皱木耳的基因组序列、基因注释文件、蛋白序列文件，灰盖鬼伞、双色蜡蘑（Laccaria bicolor）、草菇（Volvariella volvacea）等的漆酶蛋白序列。皱木耳、双孢蘑菇（Agaricus bisporus）、黑木耳、变色栓菌等的漆酶参考序列从UniProt 数据库获取。

1.2 皱木耳漆酶序列的鉴定

首先，使用HMMER 软件构建漆酶的保守结构域模型，E 值设置为e<10-10，比对皱木耳的所有蛋白序列，作为HMM 部分漆酶的结果。其次，为保证候选漆酶基因的准确性和完整性，以参考漆酶序列为目标序列，利用BLAST 软件从皱木耳的蛋白文件中搜索漆酶，E 值设置为e<10-4，筛选出的序列为BLAST 部分漆酶的结果。然后，将HMM 和BLAST的结果合并，并将合并后的结果通过BLASTP 软件与UniProtKB 数据库比对，E 值小于10-10的被认为是候选漆酶。最后，再利用Pfam 数据库和CDD 数据库预测这些候选蛋白的结构域，若存在结构域，则认为该候选蛋白属于漆酶；若未能检测出结构域，则认为其不属于漆酶。

1.3 皱木耳漆酶蛋白的理化性质分析

利用ProtParam 工具预测漆酶蛋白的相关理化性质，指标包括氨基酸数目、分子量、理论等电点、蛋白质疏水性等。漆酶蛋白的亚细胞定位分析使用PSLDoc[8]工具完成。

1.4 皱木耳漆酶基因结构和蛋白结构分析

通过皱木耳的基因组注释文件获取漆酶基因的结构信息，使用Tbtools[9]构建基因结构图。利用SOPMA[10]预测皱木耳漆酶蛋白的二级结构。同时，使用SWISS-MODEL 对漆酶的氨基酸序列进行同源建模，生成蛋白质三级结构。基于MEME[11]工具对皱木耳漆酶蛋白的模体序列进行分析，其中motifs 的最大数量设置为10，其他参数采用默认值。使用Pfam 数据库和CDD 数据库开展结构域预测，取2 种预测结果的并集作为最终漆酶蛋白的结构域结果。

1.5 皱木耳漆酶蛋白的系统发育分析

从NCBI 数据库和UniProt 数据库中下载双孢蘑菇、黑木耳、毛木耳、灰盖鬼伞、双色蜡蘑、射脉菌（Phlebia radiata）、糙皮侧耳、凤尾菇（Pleurotus sajorcaju）、毛栓菌（Trametes hirsuta）、变色栓菌、长绒毛栓菌（Trametes villosa）、草菇的漆酶蛋白序列。使用MUSCLE 软件对所有的漆酶序列进行比对，然后使用MEGA[12]构建系统进化树，自展值设置为1 000。

2 结果与分析

2.1 皱木耳漆酶序列的鉴定结果

通过HMMER 程序构建模型，利用该模型从皱木耳基因组中检索到13 个蛋白序列含有2 个及以上多铜氧化酶的结构域。通过BLAST 程序比对UniProtKB 数据库，发现有11 个可能是皱木耳漆酶的蛋白序列。最后，合并HMMER 和BLAST 的结果，再通过筛选序列长度、3 个多铜氧化酶结构域等特征，获得8 个皱木耳漆酶蛋白，详见表1。

表1 皱木耳漆酶基因信息分析Tab.1 Information of laccase gene in Auricularia delicata

如表1世纪，皱木耳的8 个漆酶基因长度为2.2～2.9 Kb，编码蛋白的长度也较为相近，最长为619 个氨基酸，最短为550 个氨基酸；除Ad-lac3与Ad-lac4位于同一段scaffold 上外，其余的漆酶基因都位于不同的scaffold 上。

2.2 皱木耳漆酶蛋白的理化性质分析结果

对皱木耳漆酶蛋白的理化性质进行预测，分析结果详见表2。

表2 皱木耳漆酶基因氨基酸的理化分析Tab.2 The physico-chemical analysis of amino acid in Auricularia delicata

由表2 可知，这些基因所表达的蛋白分子量为60.40～68.33 Ku，等电点为4.24～7.02，大多数在碱性范围，说明蛋白分子中富含酸性氨基酸。半衰期（酵母活体内）是判断蛋白在细胞内是否稳定的指标之一，大于20 h 的为稳定蛋白；预测结果表明皱木耳的漆酶蛋白均较稳定。总平均亲水性GRAVY（grand average of hydropathy，GRAVY）指所有氨基酸亲水值的总和与氨基酸个数之间的比值，负值代表亲水性，负值越大表明亲水性越强，而正值代表疏水性，正值越大表明疏水性越强[13]。皱木耳漆酶蛋白序列间的GRAVY 值虽存在差异，但均为亲水性蛋白。亚细胞定位的分析结果表明，有6 个皱木耳的漆酶蛋白均分泌到细胞外，可能是作为分泌蛋白在细胞外分解酶；而Ad-lac1与Ad-lac8定位于细胞质中，说明皱木耳漆酶基因的生理功能存在差异。

2.3 皱木耳漆酶基因结构和蛋白结构分析结果

利用本研究中皱木耳漆酶的蛋白序列构建8 个漆酶的系统发育树，结果详见图1。

图1 皱木耳漆酶基因的系统进化树和基因结构Fig.1 Phylogenetic tree and gene structures of Auricularia delicata laccase

由图1 可知，皱木耳的漆酶蛋白基因均含有10个以上的CDS 编码区域。系统发育关系较近的皱木耳漆酶蛋白的基因结构是相似的，如Ad-lac4和Ad-lac5的CDS 数目和排列几乎一致，这也从侧面体现了漆酶基因具有一定的保守性。

蛋白质二级结构是指不同氨基酸间C=O 和N-H基团间氢键形成的稳定结构，主要为α-螺旋和β-折叠。利用SOPMA 软件，预测皱木耳8 条漆酶基因编码蛋白质的二级结构，结果详见表3。

表3 皱木耳漆酶蛋白的二级结构Tab.3 The secondary structure of protein sequence in Auricularia delicata

由表3 可知，8 条序列的结构类型主要是不规则卷曲。其中，α-螺旋（Alpha helix）占8.36%～14.59%、β-转角（Beta turn）占25.80%～29.22%、不规则卷曲（Random coil）占47.50%～56.37%，不规则卷曲所占比例远高于其他的类型。

模体（motif）是蛋白质分子结构中介于二级结构与三级结构之间的结构层次，又称超二级结构，是蛋白质分子具有特定功能或作为独立结构域一部分的二级结构聚合体[14]。基因所有或者大多数成员共有的motif 极可能是该家族执行重要功能或组成结构不可缺少的部分[15]。所以，识别基因家族共同的motif 就能刻画该基因家族的特征，从而可以利用这些特征来发掘基因家族新成员[14]。本研究中皱木耳漆酶蛋白的基序情况详见图2。

图2 皱木耳漆酶基因的模体Fig.2 Motif of the Auricularia delicata laccase genes

如图2世纪，皱木耳的8 个漆酶蛋白均含有10个motif。其中，motif_1 中的HCHxxxH、motif_2 中的HWH、motif_4 中的HPxHLH、motif_6 中的HSH与报道的真菌漆酶的特征序列和草菇的漆酶蛋白序列具有一致性[16]。

在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠形成1 个或多个相对独立的致密三维实体，即结构域（domain）[17]。一般每个结构域由100～200 个氨基酸残基组成，各有不同的空间构象，并具有不同的生物学功能。根据已有的研究报道，真菌漆酶一般都含有3 个多铜离子氧化酶结构域，排列为Cu-oxidase_3、Cu-oxidase 和Cu-oxidase_2。在多铜氧化酶的研究中发现了3 种光谱上不同的类型：1 型（蓝色）、2型（正常）和3 型（耦合双核），利用铜离子特有的氧化还原能力，对还原性底物进行单电子氧化，同时传递4 个电子，将作为第二底物的氧气还原成水[18]。本研究中得到的8 个皱木耳的漆酶蛋白序列的情况详见图3。

图3 皱木耳漆酶基因的结构域Fig.3 Domain of the Auricularia delicata laccase genes

如图3世纪，皱木耳的漆酶蛋白序列也同样有这样的结构域和相应的排列顺序，进一步说明筛选出的皱木耳漆酶也应具有相同的生物学功能。

通过Swiss-Model 对皱木耳的漆酶蛋白序列进行三维结构同源建模，结果详见图4。

图4 皱木耳漆酶蛋白三维结构Fig.4 Protein 3D structure of Auricularia delicata laccase

如图4世纪，8 个漆酶蛋白大部分都具有十分相似的三维结构。每个蛋白由3 个杯状（Cu-oxidase）结构域（Domain 1、Domain 2、Domain 3）组成，每个结构域均有1 个β 桶状结构。8 个皱木耳漆酶蛋白的三维结构由多个α-螺旋和β-折叠构成，都具有对应的铜离子结合位点和催化的活性中心。

2.4 皱木耳漆酶蛋白的系统发育分析结果

通过合并8 条皱木耳的漆酶蛋白序列和下载的69 条蛋白序列，总计77 条漆酶序列，构建系统发育树，结果详见图5。

图5 皱木耳及其他物种漆酶蛋白序列的系统发育树Fig.5 Laccase protein sequences phylogenetic tree of Auricularia delicata and other species

如图5世纪，77 条漆酶主要分为7 个类群，主要的大类群是木耳属与栓菌属（Trametes），其他的各个类群的聚类关系与其物种相对应。本研究中筛选出的皱木耳漆酶与木耳属的黑木耳、毛木耳的漆酶聚为一枝（枝长颜色为红色），表明皱木耳的漆酶与木耳属其他物种漆酶的基因之间具有较高的保守性。其中，Ad-lac3、Ad-lac7和Ad-lac8各在1 个分枝上；Ad-lac1和Ad-lac2聚为一枝；Ad-lac4、Ad-lac5和Ad-lac6聚为一枝。结合皱木耳漆酶的基因结构和蛋白结构的分析结果，发现亲缘关系较近的漆酶蛋白的基因结构具有一致性。

3 结论与讨论

针对皱木耳的漆酶进行了生物信息学分析，结果表明在皱木耳基因组中有8 个漆酶基因，分布在基因组的不同位置，这与目前报道的担子菌和子囊菌中漆酶基因通常成簇排列是不一致的[19-21]。原因可能是皱木耳的基因组测序时间较早，测序组装技术具有局限性，导致基因组碎片化程度较高及注释不完全，最终使筛选结果不全面。进一步分析了皱木耳漆酶蛋白氨基酸的定位与理化性质，发现8 个皱木耳的漆酶蛋白理化性质总体差异较小，但Adlac1与Ad-lac8基因所表达的蛋白不是细胞外的分泌蛋白，2 个漆酶蛋白可能是在细胞内行使功能。在皱木耳的基因结构分析结果中也可以看出，皱木耳不同漆酶的基因结构不一致。漆酶在真菌的形态建成、色素合成、应激反应等生长发育过程中起重要的作用，不同物种的漆酶也应该具有一定的保守性。皱木耳的8 个漆酶蛋白的二级结构以不规则卷曲为主，这与黑木耳漆酶蛋白情况相似。同时，对皱木耳8 个漆酶模体的分析发现，HCHxxxH、HWH、HPxHLH、HSH 等序列的特征与草菇等的漆酶蛋白序列具有一致性；结构域分析发现，多铜离子氧化酶结构域的排列特征与毛栓菌、变色栓菌等的研究结果一致[16]。8 条漆酶蛋白序列的三维结构特征与二级结构、模体、结构域的结果一致。这些特征都表明筛选出的8 个漆酶蛋白具有生物学功能，在皱木耳的生长发育中扮演着重要的角色。而系统发育树的结果则说明，同一类群物种的漆酶具有较近的亲缘关系，可能受相似的选择压力作用，具有相似的生物学功能，以便适应相应的生存环境。

目前皱木耳的研究仍聚集在生物学特性、驯化及栽培上，本研究中首次较全面地从皱木耳基因组中筛选出漆酶序列，对皱木耳漆酶基因结构、蛋白质结构等进行了分析，阐释了皱木耳漆酶基因的特性和各基因之间的差异。同时，了解了皱木耳漆酶不同成员之间的相互关系。而对于皱木耳的每一个漆酶的生物学功能，还需要进行基因克隆以及表达分析来验证。研究结果为阐明皱木耳的生长发育过程、漆酶的开发利用等提供了理论支持和试验依据。