宫颈鳞状上皮内病变与EBP50、p16 和Ki-67 表达的相关性分析#

陈婷婷 王晓梅 修小斐 孙红静 高峰

（河北医科大学第三医院病理科，河北 石家庄 050051）

宫颈鳞状上皮内病变（Squamous intraepithelial lesion，SIL）是宫颈鳞状细胞癌的癌前病变，包括低级别鳞状上皮内病变（Low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）和高级别鳞状上皮内病变（High-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）[1]。SIL 的病理诊断对阻止SIL 向浸润性宫颈癌转变尤为重要。近年来研究发现Ezrinradixin-moesin 结合磷酸化蛋白50（Ezrin-radixinmoesin binding phosphoprotein 50，EBP50）在肿瘤发生发展中发挥重要作用[2]。在胆管癌，大肠癌，食道癌等中EBP50 表达明显减少，且与肿瘤分化程度、T 分期、淋巴结转移相关[3-5]。但EBP50 在SIL 中的表达情况未见报道。尽管宫颈病变中p16/Ki-67 联合检测有助于提高HSIL 的检测率[6]，但EBP50 与p16、Ki-67 的相关性研究未见报道。本实验通过免疫组化比较 EBP50 在正常宫颈组织和SIL 中的表达情况，并分析EBP50、p16 和Ki-67 在SIL 中表达的相关性，探讨EBP50 在宫颈病变发生、发展中的作用及病理诊断意义。

1 材料与方法

1.1 标本收集

收集2018 年10 月至2020 年06 月在河北医科大学第三医院宫颈活检及手术切除SIL 标本80例，分为两组：LSIL 为24 例，HSIL 为56 例。SIL 患者的中位年龄为44 岁（25 岁至79 岁）。对照组为21 例宫颈病变周围区域的正常宫颈组织。所选病理标本经10%中性福尔马林固定，进行组织脱水，石蜡包埋。

1.2 试剂

兔抗人EBP50 单克隆抗体购自Abcam 公司。小鼠抗人p16、Ki-67 单克隆抗体及免疫显色试剂（Max Vision-HRP）购自福州迈新公司。

1.3 免疫组化检测EBP50、p16 和Ki-67 表达

将石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2甲醇溶液阻断内源性过氧化物酶，微波热处理修复抗原，然后分别加入EBP50（1:200）、p16（1:100）和Ki-67（1:100）抗体，4°C 孵育过夜后加入免疫显色试剂（Max Vision-HRP）在37°C 孵育30 min。滴加DAB 显色液，用苏木精复染后，将切片脱水并封固。PBS 代替一抗，做阴性对照。

1.4 结果判定

EBP50 蛋白表达于细胞核和细胞质。根据临床病理特征的相似性，将EBP50 阴性和弱染色判定为低表达，中和强染色判定为高表达。p16 阳性染色为鳞状上皮下1/2 或超过下1/2 出现连续弥漫性的细胞核和细胞质染色，p16 完全不染色或局灶斑点状上皮染色时为阴性表达。Ki-67 的核染色主要出现副基底层且阳性细胞数＜30%为阴性表达，超过副基底层以上出现细胞核染色且阳性细胞数≥30%判定为阳性表达。

1.5 统计学分析

采用SPSS 23.0 进行数据分析。采用卡方检验分析正常宫颈组织与SIL 中EBP50 表达的差异，以及不同级别SIL 中EBP50、p16 和Ki-67 表达的差异。Spearman 相关性检验分析EBP50 与p16、Ki-67 表达的相关性。P 值＜0.05 具有显著性。

2 结果

2.1 正常宫颈组织和SIL 中EBP50、p16 和Ki-67表达

免疫组化检测正常宫颈组织和SIL 中EBP50、p16 和Ki-67 表达，见图1、图2、表1。正常宫颈组织中EBP50 高表达染色为19 例（90.5%），而低表达2 例（9.5%）；30 例（37.5%）SIL 中EBP50 高表达染色，50 例（62.5%）为低表达；正常宫颈组织中EBP50 表达水平明显高于SIL（χ2=16.429，P=0.000）。p16 在全部正常宫颈组织中表达阴性，而80 例SIL 中p16 阳性表达为66例，占82.5%。SIL 中Ki-67 阴性表达为30 例（37.5%），Ki-67 阳性表达为50 例（62.5%）；21例正常宫颈组织Ki-67 表达均为阴性；SIL 中p16和Ki-67 表达明显高于正常宫颈组织（χ2=49.995，P=0.000；χ2=25.993，P=0.000）。

表1 正常宫颈组织和SIL 中EBP50、p16 和Ki-67 表达

图1 正常宫颈组织中免疫组化（×200）

图2 免疫组化代表图（×200）

2.2 EBP50、p16 和Ki-67 在SIL 中的表达

在LSIL 中，EBP50 低表达6 例（25.0%），高表达18 例（75.0%）；而HSIL 中EBP50 高表达12 例（21.4%），低表达44 例（78.6%）；EBP50 高表达率从LSIL 到HSIL 显著下降（χ2=20.571，P=0.000），见图2、表2。14 例（58.3%）LSIL 中p16 呈阳性表达，10 例（41.7%）LSIL 中p16 染色阴性；在HSIL 中，p16 阳性表达为52 例（92.9%），而p16 阴性表达为4 例（7.1%）；p16 在HSIL 中的表达阳性率明显高于 LSIL（χ2=13.696，P=0.000），见图2、表2。Ki-67 阴性表达分别为LSIL 的22 例（91.7%）和HSIL 的8 例（14.3%）；Ki-67 阳性表达的病例中LSIL 为2 例（8.3%），HSIL 为48 例（85.7%）；HSIL 的Ki-67 阳性率明显高于LSIL（χ2=42.921，P=0.000），图2、表2。

表2 SIL 中EBP50、p16 和Ki-67 表达

2.3 SIL 中EBP50 与p16、Ki-67 表达的相关性

Spearman 相关性检验显示，SIL 中EBP50 与p16、Ki-67 表达之间存在显著相关性，EBP50 与p16、Ki-67 的表达呈负相关（r=-0.459，P=0.000，r=-0.360，P=0.010），见表3。

表3 SIL 中EBP50 与p16、Ki-67 表达的相关性

3 讨论

宫颈癌近年来发病率有明显上升趋势。LSIL可自行消退，而HSIL 更易发展为浸润性癌[7]。SIL分级的病理诊断对患者的临床治疗极为重要。因此，在宫颈病变中寻找一些生物标志物对SIL 的诊断非常重要。EBP50 由两个串联的PDZ 结构域组成，参与蛋白质-蛋白质之间的相互作用[2]。本研究结果表明，21 例正常宫颈组织中EBP50 的高表达率为90.5%，而80 例SIL 中EBP50 的高表达率降至37.5%。此外，EBP50 在LSIL 中的高表达明显高于HSIL，提示EBP50 可能在SIL 中失去对宫颈鳞状上皮的保护作用。p16 是一种细胞周期调节蛋白，具有抑制细胞生长和肿瘤的生物学特性[8]。据报道，在正常的宫颈鳞状上皮中，p16完全缺失或偶有局灶阳性[9]。HPV E7 蛋白抑制视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma，Rb）蛋白，导致p16 蛋白积聚和子宫颈细胞增殖，因此p16 可以提高宫颈疾病诊断的准确性[10]。HPV E6/E7mRNA高表达是子宫颈癌变得重要标志[11]。HPV16 病毒产生的癌蛋白E6 以PDZ 依赖的方式结合EBP50 促进EBP50 的降解。E7 通过CDK1/2诱导EBP50磷酸化，促进E6 结合和降解EBP50[12]。在HPV16 阳性子宫颈癌来源的细胞系（例如SiHa和CaSki）也观察到EBP50 蛋白水平的下调[13]。在本研究的80 例SIL 患者中，p16 的阳性率从LSIL 的58.3%上升到HSIL 的92.9%，提示p16有助于识别SIL 的分级。大部分LSIL 病例EBP50高表达，p16 阴性表达。而在HSIL 中大部分p16阳性，EBP50 低表达。通过SIL 中EBP50 和p16之间的相关性，发现EBP50 表达与p16 表达呈负相关。Ki-67 是细胞增殖的指标，是一种在增殖细胞中表达的核抗原。除静止期（Go）外，该抗原在细胞周期的所有阶段均有表达[14]。Ki-67 标记指数与SIL 的程度成正比[15]，Ki-67 染色可以预测SIL 进展，在这方面优于标准的组织病理学分级[16]。研究中可得出，Ki-67 在LSIL 中的阳性率为8.3%，而在HSIL 中的阳性率为85.7%。显然，Ki-67 在LSIL 中的阳性率远低于HSIL。p16 和Ki-67 的免疫组化结果是LSIL 和HSIL 病理诊断的重要参考指标。与p16 一样，EBP50 与Ki-67表达呈负相关。综上所述，正常宫颈组织中EBP50表达多数以高表达为主，而SIL 中以低表达为主。p16 和Ki-67 蛋白的表达均随SIL 的级别增加而增加，而EBP50 在SIL 的级别中呈负相关。鉴于此，我们推测EBP50 有可能作为诊断早期宫颈癌前病变的免疫标志物。