氯化两面针碱对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响

朱长吉,李红红,沈忠军,玄延花,严 莉

(1.延边大学医学院,吉林 延边133000;2.吉林大学第二医院 检验科;3.延边大学医学院 病理学教研室;4.长春市中心血站)

胶质瘤(glioma)是成人最常见的原发性颅内肿瘤,约占中枢神经系统肿瘤的70%。尽管近年采取了多项治疗措施,包括手术治疗、联合放疗和化疗及生物治疗等,但胶质瘤的预后仍然很差,特别是恶性胶质瘤胶质母细胞瘤(glioblastoma),诊断后的中位生存期仅有14.6个月[1]。恶性胶质瘤具有快速增殖和高度侵袭性的特点、术后复发率高、预后不良。氯化两面针碱(nitidine chloride,NC)是植物中提取的一种生物碱,主要从芸香科花椒的根中提取而来。有研究表明,NC在乳腺癌和肝癌等多种癌症中具有抗癌作用,可能通过诱导细胞凋亡、阻断细胞周期、阻碍血管生成及抑制肿瘤细胞迁移和侵袭等机制发挥作用[2-5],然而,NC对胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭的作用尚有待阐明。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人脑胶质母细胞瘤LN18细胞(上海通派生物科技公司)。NC(四川恒诚致远生物公司),DMEM培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(以色列Bioind公司),二甲基亚砜(DMSO)、青霉素和链霉素(上海联迈生物公司)、CCK-8试剂盒(上海尚宝生物公司)、Transwell小室(美国Corning公司)、电泳仪和转膜仪(北京六一仪器厂)、酶标仪(北京六一仪器厂)、倒置显微镜(深圳博视达光学仪器公司)。

1.2 细胞培养和分组LN18细胞采用含10%胎牛血清、青霉素(100U·mL-1)和链霉素(100 mg·L-1)的DMEM培养基,在37℃、5%CO2培养箱中培养。每2天更换1次培养基,当细胞达80%～90%融合时取对数生长期细胞用于实验。细胞分为2组:在细胞培养基中加入NC为处理组,只加入培养基为对照组。

1.3 CCK-8法检测细胞存活率及计算IC50选择NC合适浓度准备好实验所需试剂,向96孔板里加200 μl培养基,调整细胞密度为每孔8 000个细胞左右,待细胞贴壁后,向细胞培养基中加入不同浓度NC,使96孔板中每孔NC的浓度分别为0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和15.0 μM,对照组加入等体积的培养基,置于培养箱中培养。次日取出96孔板,每孔加入CCK-8试剂20 μl,继续放入培养箱培养0.5 h。用酶标仪在450 nm波长处测定每个孔的吸光度值(A值)。细胞存活率=处理组A值/对照组A值×100%。IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)],重复4次,取平均值。公式中Xm:设计的最大浓度的对数值;i:各浓度倍比浓度的对数值;ΣP:各组生长抑制率之和;0.5:经验常数。

1.4 划痕实验检测细胞迁移率准备好实验所需试剂,预先在6孔板背面画出3条距离相同的水平横线,调整细胞密度,每孔1.5×105个细胞接种于6孔板中培养24 h。用1 ml的枪尖划出3条平行线,加入PBS将细胞碎片清洗干净后换成无血清培养基,用NC处理细胞后每个孔中随机选出3个视野,拍摄0 h划痕照片。继续培养48 h后拍照记录,计算细胞迁移率。细胞迁移率=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.5 Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭率准备好实验所需试剂,把实验所需枪尖和离心管放在冰盒中预冷处理,稀释Matrigel基质胶,每个Transwell小室加60 μl,室温放置8 h,固化培养基。接种细胞前水化基底膜。取生长良好的细胞,收集后细胞计数,取离心管每管内加200 μl含50 000细胞的无血清培养基,对照组不处理、NC组处理组加不同浓度的NC,混合均匀加入小室内,下室加含血清培养基 800 μl,在培养箱内孵育48 h。PBS清洗小室,加4%多聚甲醛固定,30 min后用0.1%结晶紫染色,再一次PBS清洗晾干。每个样本随机选取3个视野,显微镜拍照记录实验结果。计数视野下的穿膜细胞数。细胞侵袭率=处理组穿膜细胞数/对照组穿膜细胞数×100%。

2 结果

2.1 NC对胶质瘤细胞存活率的影响及NC合适浓度的选择结果显示,浓度低于2.5 μM的NC处理LN18细胞24 h对细胞存活率影响不明显。用浓度高于2.5 μM的NC处理LN18细胞24 h和48 h,不同浓度的NC对降低细胞存活率的影响均比较明显,随着NC浓度的增加,细胞存活率逐渐降低,呈浓度依赖性(表1)。在作用时间48 h时IC50浓度在5.0 μM到7.5 μM之间,因此选择5.0、7.5 μM 两个浓度的NC进行后续实验。

表1 NC对胶质瘤LN18细胞存活率的影响

2.2 NC对胶质瘤细胞迁移能力的影响结果显示,与对照组比较,NC处理后LN18细胞的划痕距离比对照组明显增大,细胞迁移率也明显降低,细胞迁移率随NC浓度的增加而降低(图1,表2)。

图1 NC对胶质瘤LN18细胞划痕距离的影响(×100)

表2 NC对胶质瘤LN18细胞迁移率的影响

2.3 NC对胶质瘤细胞侵袭能力的影响Transwell侵袭实验结果显示,与对照组比较,NC处理后LN18细胞的穿膜细胞数明显减少,细胞侵袭率明显降低,细胞侵袭率随NC浓度的增加而降低(图2,表3)。

图2 NC对胶质瘤细胞穿膜细胞数的影响(×200)

表3 NC对胶质瘤LN18细胞侵袭率的影响

3 讨论

本研究采用CCK-8法检测结果显示,与对照组比较,LN细胞用不同浓度NC处理24 h和48 h后,细胞存活率呈浓度依赖性降低,说明NC能抑制LN细胞增殖。这可能与NC对肿瘤细胞周期的影响有关。有研究表明,NC能诱导乳腺癌细胞周期停滞[2],NC可诱导神经胶质瘤细胞在G2/M期的细胞周期停滞[6]。

本研究细胞划痕实验和Transwell小室侵袭实验结果显示,与对照组比较,经不同浓度NC处理后LN18细胞的划痕距离和细胞迁移率明显降低,细胞侵袭率也明显降低,说明NC能抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭,但NC抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭的机制尚不清楚。高度侵袭性生长是胶质瘤的重要特征之一,恶性胶质瘤主要侵入周围正常脑组织及血管周围间隙,与正常脑组织的界限不清楚,也难以通过手术完全切除肿瘤,术后常常复发,这是胶质瘤预后不良的主要原因[7]。在侵入周围脑组织及血管周围间隙过程中,胶质瘤细胞通常会发生一些行为学变化,包括获得间质细胞表型、降解细胞外基质(ECM)能力和干细胞表型等。上皮-间质转化(EMT)是恶性肿瘤细胞获得间质细胞表型、增加迁移和侵袭能力的重要生物学基础[8]。近年多项研究证明,脑胶质瘤细胞能够发生EMT[9-10]。有研究表明,NC能够抑制乳腺癌细胞的EMT[11];NC可抑制骨肉瘤细胞EMT减少细胞侵袭能力[4]。在Transwell小室侵袭实验中,将基质胶(Matrigel)铺在聚碳酸酯膜上制备人工基底膜。当肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶(MMPs)等蛋白酶水解类降解基质胶后,细胞移动到膜的下室面,通过计数膜下室面的细胞数,可反映肿瘤细胞在体外的侵袭能力。一项研究表明,NC通过抑制MMP-2和MMP-9活性来减弱肾癌细胞细胞的侵袭力[12],NC通过降低MMP-2和MMP-9活性抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭[3]。

综上所述,本研究通过体外实验证实NC能抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭,在胶质瘤治疗中具有较好的应用前景。但把NC应用于胶质瘤的临床治疗,还需考虑NC的脏器毒性及通过血脑屏障等问题。