大肠埃希菌临床株QD24对黏菌素和碳青霉烯类耐药的机制

王晓慧,贾 楠,王 笑 ,2,姜美妍,朱元祺,2*

(1.青岛大学附属医院,山东 青岛266003;2.青岛大学医学部,山东 青岛266071; 3.淄博市张店区人民医院,山东 淄博266034)

新德里金属-β-内酰胺酶(NDM)是最常见的碳青霉烯酶,除了氨曲南外,对几乎所有的β-内酰胺类抗生素具有水解作用。目前,包括blaNDM-1到blaNDM-48(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/refgene/#NDM)在内的48个基因变体编码NDM酶[1]。其中,blaNDM-13基因于2015年由Shrestha首次报道[2]。黏菌素是治疗碳青霉烯耐药细菌引起的感染的最后手段[3]。然而,质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1的出现引起了广泛关注[4]。一旦mcr-1和blaNDM-13共存,这将威胁到碳青霉烯类耐药菌的抗感染治疗,但目前尚无同时携带这两个基因的病原体的报道。因此,本文是对同时携带mcr-1.1和blaNDM-13耐药基因的ST69型大肠埃希菌临床分离株进行研究,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株大肠埃希菌临床株QD24分离于2019年住院尿路感染患者的尿标本。脉冲场凝胶电泳的分子量标记为沙门菌H9812;仪器质控菌株为ATCC 25922和ATCC 700603;叠氮钠耐药大肠埃希菌J53AziR为质粒液相接合受体菌(E.coliJ53AziR)。以上菌株均为本实验室保存。

1.2 仪器和试剂细菌鉴定和药敏为VITEK 2 Compact 全自动系统,结果判定按照CLSI-M100-2021[5];碳青霉烯酶检测卡为北京金山川公司生产;凝胶成像仪和脉冲场电泳(PFGE)系统为BIO-RAD公司。

1.3 S1核酸脉冲场凝胶电泳和Xba I脉冲场凝胶电泳具体操作步骤和结果解释依据相关文献报道的方法[6-7]。

1.4 液相接合试验大肠埃希菌临床株QD24与E.coliJ53AziR的液相接合操作步骤参照相关文献进行[6]。

1.5 大肠埃希菌临床株QD24的全基因组测序采用二代Illumina和三代Nanopore测序平台以获得QD24株的染色体和质粒序列,然后利用在线软件,如ResFinder(4.1)和PlasmidFinder(2.1)等,分析该菌株的生物学信息。

2 结果

2.1 大肠埃希菌临床株QD24的碳青霉烯酶筛检和药敏结果

经碳青霉烯酶检测卡(北京金山川)检测,大肠埃希菌QD24株产NDM型碳青霉烯酶。这株(QD24)菌除了对替加环素敏感外,对多黏菌素、碳青霉烯类、磷霉素、青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类和喹诺酮类等常用抗菌药物耐药,药敏结果见表1。

表1 QD24株与其接合子和E.coli J53AziR的药敏结果

2.2 大肠埃希菌临床株QD24测序数据的分析

经Illumina和Nanopore技术平台获得QD24株的染色体和携带的质粒序列,经在线软件分析结果为:①QD24株的多位点序列分型(MLST)为ST69(adk_21、fumC_35、gyrB_27、icd_6、mdh_5、purA_5和recA_4)。②该菌株携带了3个质粒,依大小分别命名为pQD24-1、pQD24-2和pQD24-3。③pQD24-1属于IncHI2型质粒,除了携带多黏菌素耐药基因mcr-1.1外,还携带多个类型的耐药基因;pQD24-2为IncFIA/IncFIB 型杂合质粒,携带了超广谱β-内酰胺酶耐药基因blaCTX-M-55和其他多个耐药基因;pQD24-3属于IncB/O/K/Z型质粒,携带了碳青霉烯类耐药基因blaNDM-13和 磷霉素耐药基因fosA3。测序分析的详细结果见表2。

表2 QD24株测序数据的生信分析结果

对Pubmed数据库中有关blaNDM-13基因的报道和/或提交该基因序列的有关信息进行了分析。到目前为止,在已经提交6个序列(不包括本研究)中,blaNDM-13基因有5个位于质粒上,另外1个位于染色体上[2,8-10]。另外,在提交的序列中,仅有3个为完整的质粒环形序列(KX094555,CP092912和MN219406)[8,10],质粒大小分别为54 kb、88 kb和98 kb。本研究与已报道blaNDM-13基因的比较详见表3。

表3 QD24株与提交的blaNDM-13基因序列的比较

2.3 液相接合试验和接合子的鉴定及药敏结果

为探讨QD24菌株携带的质粒和耐药机制,将供体菌QD24与受体菌E.coliJ53AziR进行液相接合试验,成功地获得了接合子,被命名为QD24-C。QD24-C的验证:①药敏表型,与QD24菌株比较,接合子QD24-C对氨曲南、多黏菌素显示为敏感,而前者为耐药。QD24、QD24-C和E.coliJ53AziR药敏结果的比较详见表1。②碳青霉烯酶检测接合子QD24-C,提示产NDM酶。③ S1-PFGE显示QD24携带3个质粒,其分子大小与测序数据pQD24-1、pQD24-2和pQD24-3的结果相一致,而接合子QD24-C携带1个与pQD24-3大小相同的质粒,S1-PFGE结果见图1。④因为供体菌和接合子都是大肠埃希菌,为了避免接合子QD24-C可能是由大肠埃希菌QD24(尽管理论上该菌对叠氮钠敏感)丢失了质粒而来,所以将这两个菌进行Xba I酶切脉冲场凝胶电泳图(PFGE)以检测其同源性。依据规则[7]分析PFGE图像,结果表明这两菌无同源性,即QD24-C为获得来自供体菌pQD24-3质粒的E.coliJ53AziR,PFGE结果详见图2。

图1 S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳图(S1-PFGE)

图2 Xba I酶切脉冲场凝胶电泳图(PFGE)

上述结果提示,大肠埃希菌QD24可将携带blaNDM-13基因的pQD24-3质粒经液相接合传递到E.coliJ53AziR。但是,携带多黏菌素mcr-1.1基因的pQD24-1质粒却不能经液相接合进行传递。

3 讨论

碳青霉烯类和黏菌素是临床治疗多重耐药革兰氏阴性病原体感染的重要抗生素。本研究的大肠埃希菌QD24株除了对替加环素敏感外,对多黏菌素、碳青霉烯类、磷霉素、其他β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类等常用抗菌药物耐药,呈现泛耐药表型。另外,测序分析显示QD24株携带了黏菌素耐药基因mcr-1.1、磷霉素耐药基因fosA3、编码产碳青霉烯酶的基因blaNDM-13和超广谱β-内酰胺酶基因blaCTX-M-55。此外,该菌还同时携带了多个耐药相关基因,如氨基糖苷类和喹诺酮类,并且这些基因型与其耐药表型相符合。

目前,编码新德里金属β-内酰胺酶(NDM)有48个blaNDM基因亚型[1],包括blaNDM-1到blaNDM-48。其中,blaNDM-13基因编码的NDM-13酶是一种与NDM-1相比具有两种氨基酸取代(D95N和M154L)的变体,导致对头孢噻肟的水解活性增加[2]。迄今为止,在5株大肠埃希菌中检测到NDM-13基因,分离自尼泊尔(1株)[2]、中国(3株)[8]和韩国(1株)[9]的菌株。另外,最近在中国福建厦门来源的1株沙门菌(Salmonella Rissen)中,也检测到blaNDM-13基因[10]。与上述报道不同的是,本研究的ST69型大肠埃希菌QD24株除了携带blaNDM-13基因外,还同时携带黏菌素耐药基因mcr-1.1。

黏菌素是治疗由多重耐药革兰氏阴性细菌引起的感染的最后手段之一。然而,这种抗生素的广泛使用导致了黏菌素耐药的出现,这可能是染色体或质粒介导的。目前,人们已经认识到肠杆菌目细菌对黏菌素的抗性可能是由于染色体机制和(或)质粒携带的移动黏菌素抗性基因(mcr)[4,11]。质粒介导耐黏菌素归因于mcr基因,包括mcr-1到mcr-10,其中mcr-1是最主要的mcr类型[11-12]。到目前为止,已经有34种mcr-1的等位基因变异体,从mcr-1.1变体到mcr-1.34(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/refgene/#MCR)。质粒中发现的mcr-1基因属于不同的不相容组(IncI2,IncHI2,IncP,IncX4,IncFI,IncFIB),这介导了它们可以向不同细菌物种的水平转移。本研究的大肠埃希菌QD24中的pQD24-3质粒(携带有blaNDM-13基因)可经液相接合传递到受体菌E.coli J53AziR,但携带mcr-1.1基因的pQD24-1质粒却不能经液相接合传递(该质粒属于IncHI2不相容组),这提示QD24菌株对黏菌素和碳青霉烯类抗生素的耐药可能是由于该菌携带了mcr-1.1基因并获得了一个外源性携带blaNDM-13基因的质粒pQD24-3,但这需进一步研究。

质粒介导的耐黏菌素mcr基因的不同亚型(mcr-1到mcr-10)或亚型的等位基因变异体(从mcr-1.1到mcr-1.34)与编码新德里金属β-内酰胺酶的blaNDM基因的不同亚型(blaNDM-1到blaNDM-48)可以共存于引起人体感染的同一个病原体[1]。除了感染病原体外,也可以从食物来源的细菌中发现这两个耐药基因的共存,如,Wang 等于2022年报道从肉食分离的大肠埃希菌中检测到mcr-1 和blaNDM-5 基因[13]。另外,有研究发现人体定植菌可同时携带这两个耐药基因,如Liang 等从人体肠道中分离到携带NDM-9 和 mcr-1基因的ST1011型大肠埃希菌[14]。以上表明,耐黏菌素mcr基因与碳青霉烯类耐药blaNDM基因共表达的细菌已经在环境、食品和人体以及动物中分布。然而,经数据库检索,同时携带mcr-1.1和blaNDM-13耐药基因的细菌尚未见报道。

综上所述,本研究的ST69型大肠埃希菌QD24临床株对黏菌素和碳青霉烯类耐药是因为该菌同时携带了mcr-1.1和blaNDM-13耐药基因,并且这两个基因位于不同的质粒上。