附子江西特色炮制品种“临江片”炮制工艺研究

张钰祺，颜干明，龚千锋，于欢

1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.萍乡市食品药品检验所，江西 萍乡 337055

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品［1］。始载于《神农本草经》，其功效能上助心阳，中温脾阳，下补肾阳。附子药效显著，但因其生品有大毒，临床上多用其炮制品。附子的炮制方法历代以来有火制、辅料制等多种方法［2］，其中江西特色中药炮制流派“樟帮”采用米泔水漂，加入姜片蒸制，使附子炮生为熟，以达到减毒增效的作用，饮片命名为“临江片”；是“樟帮”一大特色优势饮片［3］。

目前关于该传统饮片的相关报道十分少见，其炮制工艺、质量标准缺乏。据《樟树中药炮制全书》记载［4］，其炮制方法为：将盐附子洗去盐分，冷水漂1～2 d，用竹刀刮去外皮，清水漂净，切成2～3分(约0.66～0.99 cm)厚横片，再用米泔水漂2～3 d（早、中、晚换米泔水1 次），取出加生姜片拌匀，最后置蒸笼中蒸至透心，倒入大筛内用扇子扇凉，使其结面，边扇边铺开药片，烘干（先用大火，后用小火，经常翻动）。由于缺乏具体的工艺参数，其炮制技术经验性强，生产上受到一定的影响，临床应用亦受到限制。

为继承和发展传统炮制方法，本研究采用正交设计试验方法，结合多指标综合加权分析，优选出临江片的炮制工艺，进一步发掘并整理其特色炮制工艺，以期为临江片的生产和使用提供参考［5］。

1 材料

1.1 仪器

Dionex UltiMate3000 液相色谱仪，PDA-3000 二极管阵列紫外检测器，Chromeleon 工作站，Sartorius BS214-D 天平（万分之一），Mettler AE240 天平（十万分之一），HY-4 调速多用振荡器，GZX-9076MBE电热鼓风干燥箱等。

1.2 材料

乌头碱对照品（批号：PF191204-26，纯度：98.52%）购于美国Stanford Chemicals 公司。新乌头碱对照品（批号：110799-201608，纯度：98.5%），次乌头碱对照品（批号：110798-202010，纯度：99.2%），苯甲酰乌头原碱（批号：111794-202006，纯度：99.5%），苯甲酰新乌头原碱（批号：111795-201805，纯度：93.1%），苯甲酰次乌头原碱（批号：111796-201906，纯度：96.4%）购于中国食品药品检定研究院。盐附子采自四川江油，经江西中医药大学药学院龚千锋教授鉴定为盐附子。甲醇、乙腈均为色谱纯。

盐附片的制备方法：取盐附子，洗净，加入30倍量的清水，浸漂7 d，每日换水2 次。将浸漂后的盐附子置75 ℃烘箱内烘1.5 h 后取出，切成3 mm厚片，继续烘2 h，即得。

临江片的制备方法：盐附子洗去表面盐分，清水浸漂2 d，每天换水2 次（春夏季节为防止腐败，换水为3 次/d），捞出，刮去外皮，洗净，切6～9 mm厚横片，再用米泔水漂3 d（早、中、晚各换水1 次），捞出。辅料生姜用量、蒸制时间、烘干温度以及烘干时间按照L9（34）正交表进行试验，分别得到9 份临江片样品。

2 方法与结果

2.1 总生物碱的含量测定［6］

分别取临江片正交试验样品粉末10 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，加三氯甲烷-乙醚（1∶3）的混合溶液50 mL，以及氨试液4 mL，密塞，摇匀，放置阴凉处12 h 以上，滤过，药渣加上述混合溶液50 mL，连续振摇1 h，静置后过滤，药渣再用上述混合溶液洗涤3 至4 次，每次20 mL，滤过，合并洗液与滤液，水浴蒸干。残渣加乙醇10 mL 使溶解，转移至锥形瓶中，精密加入硫酸滴定液（0.01 mol/L）15 mL，水15 mL 与甲基红指示剂3 滴，用氢氧化钠滴定液（0.02 mo1/L）滴至黄色。每1 mL 硫酸滴定液（0.01 mol/L）相当于12.9 mg 的乌头碱（C34H47NO11）。

2.2 双酯型生物碱、单酯型生物碱含量

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil BDS C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-40 mmol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱：0～10 min，15%→25%乙腈，10～25 min，25%～30%乙腈，25～35 min，70%乙腈，35～50 min，30% →38% 乙 腈，50～70 min，38% →50%乙腈；体积流量：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：230 nm。色谱图见图1。

图1 对照品（A）及盐附片（B）的 HPLC 图

2.2.2 混合对照品溶液制备 精密称取乌头碱对照品7.27 mg、次乌头碱对照品9.84 mg、新乌头碱对照品10.06 mg、苯甲酰乌头原碱对照品3.84 mg、苯甲酰新乌头原碱对照品3.02 mg、苯甲酰次乌头原碱对照品3.00 mg，置5 mL 量瓶中，加入0.05 %盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液制备 取盐附片、临江片样品细粉约4 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，加入4 mL 浓氨水，浸润0.5 h，再加入乙醚75 mL，密塞，阴凉处放置12 h 以上，超声提取10 min，过滤，药渣加乙醚洗涤3 次，每次25 mL，滤过，合并洗液与滤液，水浴蒸干。残渣加0.05% 盐酸甲醇溶液使溶解，转移至2 mL 量瓶中，摇匀，即得。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取上述混合对照品溶液50、100、200、300、400、500 μL 分别置于5 mL容量瓶中，用0.05%盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，分别进样20 μL。以质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）制作标准曲线，回归方程分别为：新乌头碱y=196.51x+0.602，r=0.997 9，线性范围0.021～0.210 mg/mL；乌头碱y=197.3x+0.205 4，r=0.998 6，线性范围0.014～0.143 mg/mL；次乌头碱y=238.63x-1.353 1，r=0.999 8，线性范围0.019～0.195 mg/mL；苯甲酰新乌头原碱y=193.76x-0.156 2，r=0.999 6，线性范围0.006～0.056 mg/mL；苯甲酰乌头原碱y=181.9x-0.406 2，r=0.998 3，线性范围0.007～0.077 mg/mL；苯甲酰次乌头原碱y=111.25x+0.079 5，r=0.996 2，线性范围0.006～ 0.058 mg/mL；表明各成分在各自范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 取盐附片样品细粉，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6 次，进样体积为20 μL。测得样品中6 种生物碱对照品面积的RSD分别为1.50%、1.21%、0.90%、2.38%、1.72%、0.81%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重现性试验 取同一批盐附片样品细粉6 份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件进样，进样体积为20 μL。测得样品中6 种生物碱面积的RSD 分别为0.86%、0.38%、0.68%、0.54%、2.17%、1.89%，表明该方法重现性良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一盐附片样品溶液,分别于0、4、8、16、24 h 进样，进样体积为20 μL。测得样品中6 种生物碱面积的RSD 分别为0.32%、1.25%、0.85%、1.78%、1.49%、0.54%，表明该方法稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取已知6 种生物碱含量的盐附片细粉6 份，每份约2 g，精密称定。分别精密加入“2.2.2”项下混合对照品溶液0.5 mL，按“2.2.3”项下方法进行制备，按“2.2.1”项下色谱条件测定并计算回收率。结果6 种生物碱的平均回收率分别为101.1%（RSD 1.49%）、99.8%（RSD 0.96%）、100.90%（RSD 1.98%）、98.9%（RSD 2.08%）、101.3%（RSD 1.78%）、99.99%（RSD 2.11%）。

2.2.9 样品含量测定 分别取临江片正交试验样品细粉4 g，精密称定，照“2.2.3”项下方法制备，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，进样体积为20 μL，测得样品中6 种生物碱的相应峰面积。

2.3 浸出物含量

分别取临江片正交试验样品细粉4 g，精密称定，置100 mL 锥形瓶中，精密加水50 mL，密塞，称定重量，静置1 h 后，加热回流1 h，加入适量水补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸至近干，105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却0.5 h，精密称定。9 份试验样品平行操作，分别计算浸出物含量。

2.4 正交试验

2.4.1 因素和水平 依据临江片传统的炮制方法，分别考察蒸制时间（A）、辅料生姜用量（B）、烘干温度（C）和烘干时间（D），选用L9（34）正交表进行试验，具体见表1。双酯型生物碱含量为新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的含量之和，单酯型生物碱含量为苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的含量之和［7］。采用多指标综合加权评分方法进行评分，具体权重为：总生物碱、双酯型生物碱和单酯型生物碱均为附子的主要有效成分，其含量占权重均为30% ；浸出物为评价饮片质量的重要指标，其含量占权重10%。各指标均为越高越好，计算方法为：综合分=总生物碱含量/最大值×100×30%+双酯型生物碱含量/最大值×100×30%+单酯型生物碱含量/最大值×100×30%+浸出物含量/最大值×100×10%。

表1 L9（34）正交试验设计与结果

2.4.2 正交试验结果 取9 份盐附子各200 g，按表2 中的试验设计，加入不同比例的生姜片拌匀，蒸制不同时间，摊开放置待其冷却至室温，在不同温度下，烘干不同时间，得到9 份样品。取每份样品进行测定，结果见表1，采用正交设计助手V3.1 版计算机软件对综合评分进行方差分析，方差分析见表2。

表2 方差分析

通过方差分析［8］，烘干温度和蒸制时间对结果具有显著影响，四个因素的影响程度为C＞A＞D＞B，故得到临江片的最佳炮制工艺为A3B3C2D1，即：加入12%的生姜片，蒸制10 h 后，70 ℃烘4 h。

2.4.3 炮制工艺验证试验 按照优选的炮制工艺，制备3 批样品，分别测定各指标，总生物碱含量、双酯型生物碱含量、单酯型生物碱含量、浸出物含量以及综合评分结果见表3。验证试验与正交试验优选结果相近，说明优选的炮制方法稳定可行。

表3 验证试验结果 分

3 讨论

附子主含生物碱类成分，其双酯型生物碱既是主要的药理活性成分，同时也是主要的毒性成分［9］。经水解后的双酯型生物碱转变为单酯型生物碱，其毒性明显降低，进一步水解为胺醇类碱后毒性更小［10］。临江片采用的炮制方式是蒸制和姜制两种，其中蒸制由于是隔水蒸，能有效避免附子长时间与水接触而使生物碱大量流失，同时高温高湿的环境能较好地将双酯型生物碱转化为单酯型生物碱，减毒效果显著，蒸制还可使附子中的淀粉充分糊化，成品呈角质样，质地坚硬，因此不易虫蛀、易于保管，同时饮片中的成分相对均匀稳定，医生处方时易于掌握剂量［3,11］。生姜作为辅料自古与附子配伍以达到增效的功效,《本草纲目》记载“附子得生姜则能发散，以热攻热，又导虚热下行，以除冷病”，姜制可使附子功效增加。蒸制减毒与姜制增效，使得临江片独具特色和功效［3］。

为证明其减毒的效果，实验采用HPLC 法建立了酯型生物碱的含量测定方法，可同时检测附子中的6 种酯型生物碱，方法操作简单，稳定可行。对比了盐附片和临江片的生物碱含量变化情况后发现：盐附子经樟帮法炮制为临江片后，双酯型生物碱含量大大下降，从221 μg/g 下降至25 μg/g，单酯型生物碱含量显著增加，从55 μg/g 增加至240μg/g，总生物碱含量从175 μg/g 增加至239 μg/g，证明樟帮法炮制附子能有效地保留生物碱成分，同时降低了毒性成分的含量，符合附子炮制减毒增效的目的。

实验首次使用多指标综合加权分析法优选临江片的炮制工艺，以总生物碱、双酯型生物碱、单酯型生物碱以及浸出物为考察指标。通过预试验，筛选出影响临江片成分和活性影响较大的因素，即生姜用量、蒸制时间、烘干温度以及烘干时间。通过正交试验，确定了临江片的最佳炮制工艺，即：加入12%的生姜片，蒸制10 h 后，70 ℃烘4 h，炮制出的饮片，片形美观，质地坚硬，半透明，呈角质样光泽，且有姜香气，极少灰屑，符合原书记载，可为今后发展与应用临江片这一优势传统饮片提供炮制工艺技术参考。