血浆lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7表达对非小细胞肺癌的诊断价值研究

苏 芳, 石志浩, 赵 静, 陈 萍, 李 坚

(江苏大学附属医院, 1. 呼吸与危重症医学科, 2. 老年医学科, 江苏 镇江, 212001)

肺癌是常见的肿瘤之一,发病率及病死率均位居高位[1]。在中国,根据2022年国家癌症中心发布的全国癌症数据结果,每年80多万人被诊断为肺癌,近85%肺癌患者为非小细胞肺癌(NSCLC)[2]。高发病率、进展快、高病死率、预后差是NSCLC的主要流行病学特点[3]。临床上,少部分NSCLC患者可在早期(Ⅰ期或Ⅱ期)被明确诊断[4], 超过60%的肺癌患者因局部晚期或远处转移等表现诊断癌症晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)[5], 侵袭、转移和复发是NSCLC的重要特点,与预后不良密切相关[6]。早期发现、诊断并干预肿瘤生长,有助于降低病死率,改善预后,延长生存期。因此,寻找诊断NSCLC的高特异性、高敏感的生物标志物仍是防治肺癌的热点。

长链非编码RNA(lncRNA)具有组织特异性表达,影响细胞增殖、凋亡和分化,其可用于癌症的诊断、预后和治疗[7]。研究[8]表明, lncRNA小核仁宿主基因20(lncRNA-SNHG20)在NSCLC肿瘤组织中表达上调,促进NSCLC细胞的增殖和迁移,进而影响预后。lncRNA转录因子7(lncRNA-TCF7)在NSCLC肿瘤组织中表达上调,增强NSCLC细胞侵袭性和自我更新能力[9]。但目前关于NSCLC患者血浆lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7相对表达的研究较少。本研究选取120例NSCLC患者和120例良性肺病患者作为研究对象,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血浆中lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的相对表达量,分析其与临床病理特征的相关性,并探讨SNHG20、TCF7诊断NSCLC的临床价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

分别选择2020年12月—2022年6月江苏大学附属医院收治的120例NSCLC患者(NSCLC组)和良性肺病患者(良性肺病组)。NSCLC组: ① 经细胞学或组织病理学确诊者; ② 首次确诊,且原发病灶来源于肺部,未接受过手术、化疗、放疗等肿瘤干预措施者。NSCLC组中男68例,女52例; 年龄36～78岁; 病理组织分型为腺癌93例,鳞癌27例。根据UICC肺癌TNM分期(第8版)标准,临床分期为Ⅰ～Ⅱ期20例, Ⅲ～Ⅳ期90例,未明确分期10例。良性肺病组男65例,女55例; 年龄25～80岁; 疾病类型包括慢性阻塞性肺疾病48例,哮喘8例,支气管扩张14例,肺炎50例。为保证检测结果准确性,采集20例健康成人受试者血浆样本用于lncRNA检测结果校对。本研究已获得医院人文伦理委员会批准(批件号KY2022K0121)。

1.2 血浆标本采集及预处理

抽取研究对象5 mL外周静脉血于EDTA抗凝管, 30 min内利用低速离心机留取上层血浆,置于-80 ℃冰箱冻存留用。同时送检参与者血液标本至核医学科检测癌胚抗原(CEA)及细胞角蛋白19(Cyfra21-1, 参照试剂和说明书,正常参考值上限分别为5、7 ng/mL)。

1.3 RNA提取及逆转录

利用Trizols法提取上述标本血浆总RNA, 总RNA的浓度及纯度用紫外分光光度计检测。吸取固定体积的总RNA, 根据试剂盒说明书严格进行逆转录,逆转录结束标本可直接进行实时荧光定量PCR, 也可冻存于-20 ℃冰箱待用。

1.4 实时荧光定量PCR

吸取2 μL上述逆转录所得的cDNA作为模板,严格遵循TB Green Premix Ex TaqTM试剂操作步骤执行,根据说明书配置反应体系后,应用实时荧光定量PCR仪进行两步法PCR扩增。反应条件为预变性1个循环, 95 ℃, 30 s; PCR反应40个循环, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s。任一样本的任一基因检测皆设置3个复孔。内参基因为GAPDH, 利用2-△△CT法计算上述2种lncRNAs的相对表达量。引物序列:GAPDH上游引物为5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′, 下游引物为5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′; lncRNA-SNHG20上游引物为5′-ATGGCTATAAATAGATAGATACACG-3′, 下游引物为5′-GGTACAAACAGGGAGGGA-3′; lncRNA-TCF7上游引物为5′-AGGAGTCCTTGGACCTGAGC-3′, 下游引物为5′-AGTGGCTGGCATATAACCAACA-3′。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 血浆中lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的表达水平

NSCLC组、良性肺病组血浆中lncRNA-TCF7的相对表达量分别为(3.327±0.232)、(3.124±0.135), lncRNA-SNHG20的相对表达量分别为(2.655±0.139)、(2.591±0.121)。与良性肺病组相比, NSCLC患者血浆中lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7表达水平上调,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 NSCLC患者血浆中lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的相对表达水平与临床病理参数的关系

NSCLC患者血浆中lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的相对表达水平与性别、年龄、吸烟史、病理分型及临床TNM分期无关(P>0.05), 见表1。

表1 NSCLC组血浆中lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的表达水平与临床病理参数之间的关系

2.3 血浆中lncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7、CEA和Cyfra21-1 对NCSLC的诊断效能

ROC曲线分析结果显示, lncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7、CEA、Cyfra21-1单独检测诊断NSCLC的AUC分别为0.648(0.579～0.717)、0.769(0.710～0.829)、0.755(0.692～0.817)、0.642(0.571～0.713), lncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7的AUC大于Cyfra21-1, CEA的AUC介于lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7之间。lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7联合诊断的AUC为0.772(0.713～0.832), 大于上述4种任一单独检测的AUC。lncRNA-SNHG20与lncRNA-TCF7联合Cyfra21-1的AUC为0.773(0.712～0.832), 低于lncRNA-SNHG20与lncRNA-TCF7联合CEA的AUC0.882(0.839～0.926), 但大于lncRNA-SNHG20与lncRNA-TCF7联合检测的AUC。LncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7、CEA、Cyfra21-1这4种指标单独检测及lncRNA-SNHG20与lncRNA-TCF7联合检测、lncRNA-SNHG20与lncRNA-TCF7联合Cyfra21-1、lncRNA-SNHG20与lncRNA-TCF7联合CEA的AUC比较,差异有统计学意义(P<0.05), 见图2。

lncRNA-SNHG20与lncRNA-TCF7分别联合常规肿瘤标志物CEA及Cyfra21-1后AUC增大, lncRNA-SNHG20与lncRNA-TCF7联合CEA检测诊断的敏感度提高。诊断NSCLC的cut-off值、阳性预测值、阴性预测值及准确性见表2。

表2 lncRNA-SNHG20、lncRNA-TCF7、CEA及Cyfra21-1单独诊断及联合诊断NSCLC的效能

3 讨 论

LncRNA是一组不具有蛋白翻译功能、长度超过200个核苷酸的转录本[10]。LncRNA在不同类型肿瘤细胞中异常表达,在不同水平的基因表达中发挥调控作用[11]。近年来, lncRNA因其在癌症中的调控作用而受到越来越多的关注。研究[12]发现, lncRNA异常表达可能会影响遗传表观信息,为肿瘤的细胞生长提供优势,通过调节微小RNA(miRNA)或mRNAs参与癌症进展。因此, lncRNA正在成为癌症诊断和治疗的新的标志物。

LncRNA-SNHG20位于染色体17q25.2, 具有2 183个碱基对,研究[13]认为过表达lncRNA-SNHG20可通过不同机制促进肿瘤细胞的细胞周期、增殖、侵袭和迁移能力。lncRNAs可以通过miRNAs调控卵巢癌的进展, lncRNA-SNHG20与卵巢癌的发生发展密切相关[14]。研究[15]发现,与正常人卵巢上皮细胞系相比,在4种卵巢癌细胞系中观察到lncRNA-SNHG20显著高表达,敲除lncRNA-SNHG20可抑制细胞增殖并诱导卵巢癌细胞凋亡。研究[16]表明,在卵巢癌组织和细胞中, lncRNA-SNHG20和MCL1水平上调,而miR3383p水平下调,经双荧光素酶报告分析进行发现lncRNA-SNHG20通过靶向miR-338-3p来增加MCL1的表达,从而促进卵巢癌的发展。相关研究通过检测68例结直肠癌组织及邻近正常组织的lncRNA-SNHG20表达水平发现, lncRNA-SNHG20在癌组织中呈高表达,而且癌细胞系中lncRNA-SNHG20的表达显著增加。miR495是lncRNA-SNHG20的直接靶点, STAT3被确定为结直肠癌中miR495的下游靶点, LncRNA-SNHG20通过调节STAT3表达和miR495促进结直肠癌进展[17]。此外,与癌旁组织相比,肺腺癌组织中lncRNA-SNHG20呈过表达,且lncRNA-SNHG20在肺腺癌细胞系中的表达高于正常上皮细胞系。进一步研究发现, lncRNA-SNHG20直接结合肺腺癌细胞中的miR-342, 而miR-342又直接结合DDX49, lncRNA-SNHG20通过海绵介导miR-342上调DDX49, 促进肺腺癌细胞增殖、侵袭和抑制凋亡[18]。本研究结果显示, NSCLC患者血浆中lncRNA-SNHG20呈高表达,与既往研究中lncRNA-SNHG20在肺癌、卵巢癌、结直肠癌等肿瘤组织中高表达结果相符。此外, NSCLC患者血浆中lncRNA-SNHG20表达上调,与年龄、吸烟史、性别、病理组织分型、临床分期等无明显相关性,检索Gepia数据库发现lncRNA-SNHG20的相对表达水平与NSCLC总生存期无明显相关性。

TCF7主要在T细胞中表达,在NK细胞及先天淋巴细胞的发育中其关键作用[19]。研究[20]发现,经IL-6/STAT3反激活诱导TCF7,通过上皮间质转化促进肝细胞癌的侵袭性。体外实验表明,敲低lncRNA-TCF7可以降低SK-Hep-1肝癌细胞系的细胞侵袭能力。研究表示, TCF7在结直肠癌细胞系中相对于正常结直肠上皮细胞高表达。免疫沉淀及荧光素酶报告基因分析显示,lncRNA-TCF7招募BAF170激活TCF7启动子,并调控TCF7表达。研究[21]表明, lncRNA-TCF7的下调可通过抑制TCF7的表达来抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭。通过流式细胞术及转染试验表明,沉默癌细胞中TCF7可抑制细胞增殖、迁移与侵袭,但对细胞凋亡无明显影响。表达lncRNA-TCF7可以增加细胞侵袭能力,而shRNA沉默lncRNA-TCF7可以降低NSCLC细胞侵袭能力[9]。因此,上述研究表明,lncRNA-TCF7在多种癌症中发挥促进肿瘤生长作用。本研究结果显示, NSCLC患者血浆中lncRNA-TCF7呈高表达,与上述研究肿瘤组织及细胞系高表达相符。同时, NSCLC患者血浆中lncRNA-TCF7高表达与年龄、吸烟史、性别、病理组织分型、临床分期等无明显相关性,但检索ULCAN数据库发现TCF7不仅在肺腺癌呈高表达,且在早期腺癌中TCF7的表达具有统计学意义(P<0.05)。但本研究数据表明, NSCLC患者血浆中lncRNA-TCF7的表达水平与临床分期无明显相关性,考虑可能与本研究中早期样本仅20例有关。

本研究中,单独检测lncRNA-TCF7的AUC(0.769)大于常规肿瘤标志物CEA(0.755)和Cyfra21-1(0.642), 且lncRNA-TCF7的特异度(87.5%)高于CEA(78.2%)和Cyfra21-1(67.5%)。单独检测lncRNA-SNHG20的AUC(0.648)介于CEA(0.755)和Cyfra21-1 (0.642)之间,但lncRNA-SNHG20的敏感度为81.5%, 高于CEA的72.5%和Cyfra21-1的60.5%。联合检测lncRNA-TCF7及lncRNA-SNHG20的AUC为0.772, 敏感度为73.2%, 大于TCF7单独检测的AUC, 但低于lncRNA-SNHG20单独检测的敏感度; 特异度(80.2%)低于TCF7单独检测,但高于lncRNA-SNHG20(42.5%)、CEA(78.2%)及Cyfra21-1(67.5%)。联合检测lncRNA-TCF7+lncRNA-SNHG20+CEA的AUC(0.882)、敏感度(79.0%)、特异度(83.3%)均高于联合检测lncRNA-TCF7+lncRNA-SNHG20+Cyfra21-1的AUC(0.773)、敏感度(73.2%)、特异度(80.2%)。此外,不仅联合检测lncRNA-TCF7+lncRNA-SNHG20+CEA的敏感度提高,而且检测的准确性也提高,其可能成为NSCLC诊断的新的肿瘤标志物。

综上所述,与良性肺病患者相比, NSCLC患者血浆lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7呈高表达。血浆lncRNA-SNHG20和lncRNA-TCF7的高表达与吸烟史、年龄、性别、病理分型、临床分期无明显相关性。lncRNA-TCF7、lncRNA-SNHG20和CEA联合诊断的敏感度及准确性高于单独诊断。但是,目前NSCLC的确诊仍需病理学依据,而早期肺癌多无明显临床症状, lncRNA-TCF7和lncRNA-SNHG20或可作为分子标志物在NSCLC的筛选中发挥作用。