血浆循环游离DNA水平及其完整性用于肺结节良恶性的诊断研究

居冠军, 施民新, 樊怿辉, 陈赛华, 刘红利, 龚海鹏, 朱桂娟

(江苏省南通市肿瘤医院, 1. 胸外科, 2. 检验科, 3. 影像科, 江苏 南通, 226361)

肺结节是指影像学表现为局灶性、类圆形、密度增大、直径≤3 cm且周围被含气肺组织包绕的实性或亚实性肺部阴影,而肺癌在早期常表现为肺结节。尽早鉴别诊断肺结节良恶性,对于改善治疗效果和预后具有重要意义[1-2]。目前,组织病理学检查依然是诊断非小细胞肺癌(NSCLC)的金标准,但其具有创伤性,且对较小肿瘤组织的操作难度较大,影像学检查则可了解肺癌的部位及大小,但对小结节的敏感度有限。循环游离DNA(cfDNA)是指循环血中游离于细胞外的高度片段化DNA, 源于正常细胞或肿瘤细胞,在卵巢癌、甲状腺癌等多种肿瘤中水平升高,可用于肿瘤的筛查和诊断[3-4]。癌胚抗原(CEA)和细胞角蛋白19片段抗原21-1(Cyfra21-1)是肿瘤标志物,在肺癌患者血清中水平明显升高,常被用于肿瘤诊断[5-6]。既往已有研究[7]将cfDNA浓度和cfDNA完整性用于区分恶性肿瘤患者和健康人群,但其辅助诊断肺结节良恶性的价值尚有待进一步研究。本研究以病理结果为金标准,探讨血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1检测对肺结节良恶性的诊断价值,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年7月—2020年10月在南通市肿瘤医院就诊的110例良恶性肺结节患者作为研究对象,其中男68例,女42例,年龄22～78岁,平均(48.30±8.10)岁,良性肺结节60例,恶性肺结节50例(肺腺癌31例、鳞癌19例)。纳入标准: ① 经CT诊断为肺结节,且经病理学确诊者; ② 血液采集前未接受手术、放化疗等抗肿瘤治疗者; ③ 临床资料完整者。排除标准: ① 严重心、肝、肾功能不全者; ② 伴有其他类型恶性肿瘤或肿瘤转移和复发者。另选取同期健康体检人员30例设为对照组,其中男21例,女9例,年龄22～75岁,平均(47.80±8.30)岁。各组研究对象性别、年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经南通市肿瘤医院伦理委员会审核批准(批准文号2018-039), 且患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样品采集及保存: 采集所有研究对象清晨空腹静脉血5 mL, 装入抗凝管中,于室温条件下静置30 min, 以3 000转/min离心10 min后收集血浆,置于无菌EP冻存管中, -80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测cfDNA水平: 使用cfDNA快速提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)提取血浆中总cfDNA, 试剂盒购自德国Qiagen公司,使用核酸定量仪测定波长260 nm与280 nm处的光密度比值(OD260 nm/OD280 nm), 将OD260 nm/OD280 nm为1.6～1.8的样本于-20 ℃保存备用。采用qRT-PCR检测各研究对象血浆cfDNA水平,以ALU115基因(115 bp)表示cfDNA浓度,以ALU247基因/ALU115基因表示cfDNA的完整性。ALU115引物扩增的基因包含所有的cfDNA片段(细胞凋亡途径与非凋亡途径),ALU247引物扩增的基因为非凋亡途径释放的cfDNA片段, cfDNA完整性接近1, 表示cfDNA来自于非细胞凋亡途径。ALU115及ALU247引物序列见表1, 引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。qRT-PCR总体系为20 μL, 循环参数为95 ℃预变性30 s, 95 ℃变性15 s, 65 ℃退火30 s, 72 ℃延伸10 s, 共38个循环,扩增后检测光密度值。以人类基因组DNA为标准品(美国Promega公司)绘制扩增曲线,其中标准曲线回归方程为Y=-3.186logX+39.87, 线性关系良好(R2=1), 根据标准曲线对cfDNA含量及熔解曲线进行分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 检测血浆CEA、Cyfra21-1水平: 采用化学发光法检测血浆CEA、Cyfra21-1水平, CEA、CYFRA21-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自罗氏公司,具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,不符合正态分布的计量资料采用[M(P25,P75)]描述,组间比较采用非参数检验,绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析血浆cfDNA水平及完整性、CEA、Cyfra21-1对恶性肺结节的诊断价值,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血浆cfDNA水平、cfDNA完整性比较

恶性肺结节组患者血浆cfDNA水平、cfDNA完整性均高于良性肺结节组、对照组,差异有统计学意义(P<0.001); 良性肺结节组血浆cfDNA水平、cfDNA完整性与对照组比较,差异无统计学意义(P=0.113、0.067)。见表2。

表2 3组血浆cfDNA水平、cfDNA完整性比较[M(P25, P75)]

2.2 血浆cfDNA水平、cfDNA完整性与恶性肺结节患者临床病理特征的相关性

血浆cfDNA水平、cfDNA完整性与恶性肺结节患者性别、年龄、是否吸烟、肿瘤直径、病理类型、TNM分期、肿瘤分化程度和淋巴结转移均无相关性(P>0.05), 见表3。

表3 血浆cfDNA水平、cfDNA完整性与恶性肺结节患者临床病理特征的相关性[M(P25, P75)]

2.3 血浆CEA、Cyfra21-1表达水平比较

恶性肺结节组血浆CEA、Cyfra21-1表达水平均高于良性肺结节组、对照组,差异有统计学意义(P<0.001); 良性肺结节组血浆CEA、Cyfra21-1水平与对照组比较,差异无统计学意义(P=0.073、0.095)。见表4。

表4 3组血浆CEA、Cyfra21-1水平比较[M(P25, P75)] ng/mL

2.4 血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性对恶性肺结节的诊断效能

ROC曲线分析结果显示,血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性对恶性肺结节均具有一定的诊断价值,但敏感度与特异度较低; 血浆cfDNA水平、cfDNA完整性诊断恶性肺结节的曲线下面积、敏感度、特异度均大于或高于CEA、Cyfra21-1; 血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性四者联合诊断恶性肺结节的敏感度、特异度均高于四者单独检测,差异有统计学意义(P<0.05)。见表5、图1。

表5 血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性对恶性肺结节的诊断效能

3 讨 论

NSCLC约占肺癌的80%, 早期症状不明显或缺乏特异症状,多数患者确诊时已处于疾病中晚期, 5年生存率仅16%～18%, 是癌症相关死亡的首要原因。因此,寻找稳定可靠的早期诊断生物标志物对早期诊治NSCLC和提高患者生存率具有重要意义[8-9]。

cfDNA是一种游离DNA, 可来源于人体凋亡或坏死的正常细胞,也可来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞。研究[10-11]表明,肿瘤患者血浆中cfDNA水平显著高于健康人,且cfDNA在肿瘤良恶性的鉴别诊断中具有重要意义。另有研究[12]发现,与健康者相比, NSCLC患者的血浆游离DNA水平显著升高,提示该指标水平在NSCLC早期诊断中具有一定的临床价值。王宇轩等[13]发现, cfDNA在NSCLC患者血浆中的表达水平显著高于肺部良性结节患者,对肺结节良恶性具有一定的诊断价值。本研究结果亦显示,与良性肺结节组比较,恶性肺结节组患者血浆cfDNA水平、cfDNA完整性均显著升高,其原因可能是在肺结节恶性进展过程中,局部组织供血不足,引起细胞坏死或凋亡, DNA释放,造成血浆cfDNA水平升高。SOLIMAN S E S等[14]研究表明, NSCLC患者血清cfDNA水平与NSCLC分期和转移有关,且血浆血清cfDNA水平和完整性指数在NSCLC早期诊断和预后预测方面具有一定价值。与此不同的是,本研究结果显示, cfDNA水平和cfDNA完整性与临床病理特征无相关性,这可能与本研究样本量较少有关。本研究ROC曲线分析结果显示,血浆cfDNA水平、cfDNA完整性诊断恶性肺结节的曲线下面积、敏感度、特异度均大于或高于CEA、Cyfra21-1, 提示cfDNA水平和cfDNA完整性对恶性肺结节具有一定的诊断价值,但特异度与敏感度均不高。研究[15]显示,血浆cfDNA联合血清标志物可提高对早期胃癌的诊断灵敏度。

CEA为临床常见的肿瘤标志物,在乳腺癌、结肠癌、宫颈癌等多种肿瘤患者中表达水平升高,可用于良恶性肿瘤的诊断;此外, CEA在恶性肺结节患者血清中表达水平升高,为孤立性肺结节的鉴别标志物[16-17]。Cyfra21-1是一种上皮来源性质的新肿瘤标志物,主要表达于肺组织,肺部发生癌变时,其被释放至血液中,故肺癌患者血清Cyfra21-1水平较高[18]。Cyfra21-1是肺癌的肿瘤标志物之一,且对肺结节良恶性具有一定诊断价值,但需要与其他血清标志物联合应用以提高诊断效率[19]。范伟等[20]研究表明, NSCLC患者血清CEA、Cyfra21-1水平显著升高,两者联合检测对NSCLC具有较高的诊断效能。本研究结果显示,恶性肺结节组患者血浆CEA、Cyfra21-1水平显著高于对照组与良性肺结节组,良性肺结节组血浆CEA、Cyfra21-1水平与对照组无显著差异,其可能原因是CEA为糖蛋白,是细胞膜的结构蛋白, Cyfra21-1为上皮细胞结构蛋白亚单位,在恶性上皮细胞中,激活的蛋白酶加速了细胞降解,使大量蛋白被释放至血液中, Cyfra21-1水平升高。本研究进一步分析CEA、Cyfra21-1对恶性肺结节的诊断价值,结果显示两者的敏感度、特异度均不高,但血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性四者联合诊断恶性肺结节的敏感度、特异度显著高于四者单独检测,提示四者联合检测对恶性肺结节具有较高的诊断效能,在肺结节良恶性的鉴别诊断中具有一定临床价值。但本研究样本量较少,未来还需扩大样本量进一步研究cfDNA对肺结节良恶性的鉴别诊断价值。

综上所述,恶性肺结节患者血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性均高于良性肺结节患者,血浆cfDNA水平和cfDNA完整性对恶性肺结节具有一定的诊断价值,可作为肺结节良恶性辅助诊断的分子生物学指标。