丙泊酚减轻肺炎支原体感染所致肺损伤的机制探究

彭承旭 杨坤渹 向红 吴君如

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是与儿童急性呼吸道感染相关的主要病原体之一[1]。多数MP肺炎(MP pneumonia,MPP)患者通过大环内酯类或四环素治疗后会康复;然而,由于抗生素不断使用诱发了MP耐药菌株的出现,进而导致临床难治性MPP的逐年增加[2-3]。因此,寻找治疗MPP的有效方法尤为重要。丙泊酚是一种快速、短效的静脉麻醉药,广泛用于术后及ICU患者[4]。有研究证实,丙泊酚在不同程度的肺损伤过程中均发挥保护作用[5]。但关于丙泊酚对MP感染引起的肺损伤的潜在保护作用知之甚少。PI3K/Akt信号通路广泛参与多个生物学过程[6]。丙泊酚已被证实可通过激活PI3K/Akt信号通路在缺血再灌注引发的肠和肺损伤中发挥保护作用[7]。综上,猜想丙泊酚可能通过激活PI3K/Akt信号通路对MP感染所致的肺损伤具有保护作用。

资料与方法

一、材料

雄性SD大鼠,年龄6～8周龄,体质量为(200～230)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,SCXK(京)2021-0011;MP(15531)获自美国ATCC;PPLO肉汤培养基(GD-P0094846)、大鼠MP-IgM ELISA试剂盒(GD-E015278667)、大鼠CRP ELISA(GD-E018275651)试剂盒获自上海GuanDao;丙泊酚(纯度:99.52%,HY-B0649)、阿奇霉素(纯度:98.0%,HY-17506)、渥曼青霉素(PI3K抑制剂,纯度:99.85%,HY-10197)获自美国MedChemExpress;大鼠IL-6 ELISA试剂盒(ER0042)、大鼠IL-18 ELISA试剂盒(ER0036)和大鼠TNF-α ELISA试剂盒(ER1393)均购自武汉FineTest。HE染色试剂盒(G1120)、Diff-Quik全血染色试剂盒(G1541)、TUNEL凋亡检测试剂盒(T2190)和RIPA裂解液(R0020)获自北京Solarbio;一抗p-PI3K(ab278545)、PI3K(ab191606)、p-Akt(ab38449)、Akt(ab8805)和β-actin(ab8226)均获自英国Abcam。

二、方法

1 MPP模型构建及分组

MP溶解在PPLO肉汤培养基中,在37℃下孵育。对数生长期的MP通过颜色变化单位(color change unit,CCU)进行量化,使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基调整至所需浓度。

将SD大鼠饲养在21℃,55%湿度和12 h光/暗循环下,自由获取食物和水。将大鼠分为以下5组(n=12/组):对照组、MPP模型组、丙泊酚组、阿奇霉素组和丙泊酚+PI3K抑制剂(渥曼青霉素)组。为了诱导MP感染,通过腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠将每只大鼠麻醉,一旦麻醉,对照组大鼠用生理盐水处理,其他组大鼠鼻内接种含有1×108CCU/mL的150 mL MP溶液,连续4天,每天一次,以制备MPP模型,MP检测阳性即表示造模成功[8]。丙泊酚组、阿奇霉素组从末次接种日起腹腔注射丙泊酚10 mg/(kg·d)[9]或阿奇霉素25 mg/(kg·d)[8],连续4天。对照组和MPP模型组大鼠腹腔注射等量的生理盐水,丙泊酚+渥曼青霉素组在腹腔注射丙泊酚的同时尾静脉注射15 ug/kg/day渥曼青霉素[7],连续4天。所有处理完成后,用40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后,通过心脏穿刺将血样收集到含EDTA的血浆分离管中。随后,用120 mg/kg戊巴比妥钠对大鼠实施安乐死,并立即进行尸检。收集大鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织以供进一步实验。动物实验得到本院机构动物护理和使用委员会的批准(2018论审第(WY19)号)。

2 血清MP-IgM和CRP水平检测

将血样离心后获取血清,根据试剂盒方法检测MP-IgM和CRP水平。

3 BALF中IL-6、IL-18和TNF-α表达测定

打开安乐死大鼠的胸腔,在左右支气管分叉位点对右主气管进行结扎。预冷的PBS进行3次右肺支气管肺泡灌洗,每次回收约3.5 mL灌洗液(BALF)。离心收集上清液,经对应试剂盒方法检测BALF中炎症因子IL-6、IL-18和TNF-α的水平。

4 BALF中炎症细胞的定量检测

将BALF中的细胞悬浮在1 mL PBS中,并与0.4%台盼蓝染料以1 ∶1的比例混合,将10 μL悬浮液置于腔室载玻片,并将载玻片插入自动细胞计数器,进行总细胞计数。将细胞沉淀重悬以制备涂片用于染色。使用Wright-Giemsa染色对BALF中包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞在内的炎症细胞进行计数。简而言之,通过用基于甲醇的Wright-Giemsa染色剂固定2 min,对载玻片进行染色。之后,将载玻片在Diff-Quik I溶液中染色5～10 s并立即取出。然后根据Diff-Quik全血染色试剂盒的说明,将载玻片在Diff-Quik II溶液中染色10～20 s并在室温下立即取出。最后使用自动细胞计数器从随机选择的区域中对每个样本的总共200～300个细胞进行计数。

5 肺湿干比

将大鼠安乐死后,通过钝性解剖将气管和食道与肺分开,使用PBS冲洗肺组织后称重左肺的重量(湿重)。随后在65℃进行48 h烘干,测量左肺的干重并计算湿重与干重的比率(肺湿干比)。

6 HE染色

制备常规石蜡肺组织切片,切片在40℃恒温烘箱中干燥。脱蜡、水合后,将组织用苏木精染色5 min,伊红复染30～60 s,在光学显微镜下观察以验证颜色的变化。脱水后干燥、密封,在光学显微镜下观察切片并评分。实质性肺炎评分基于炎性细胞肺泡浸润程度[10],标准如下:0分,支气管周围无炎症细胞;1分,支气管周围观察到少量的炎症细胞;2分,炎症呈细胞层厚;3分,气管周围有两到四层细胞层厚的炎症;4分,气管周围炎症呈四层细胞厚。

7 TUNEL检测

将肺组织切片自然干燥,用二甲苯脱蜡并用梯度酒精溶液水合。添加50 μL TdT酶反应溶液中,避光孵育60 min。随后,将组织切片上添加50 μL Streptavidin-TRITC标记溶液孵育30 min。通过DAPI溶液复染15 min,用封固剂密封后在显微镜下观察。Image J软件对图像中的TUNEL阳性细胞进行计数,并计算细胞凋亡率(TUNEL阳性细胞数量/总细胞数量×100%)。

8 Western Blot分析

收集大鼠肺组织,并用RIPA裂解液裂解。SDS-PAGE电泳分离蛋白质并转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h。然后将膜与一抗p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt和β-actin在4℃下过夜孵育[11]。将HRP标记的二抗孵育2 h。ECL用于可视化印迹,并用Image J软件分析灰度值,β-actin作为内参对照。

三、统计学分析

结 果

一、丙泊酚降低MPP模型大鼠血清MP-IgM和CRP水平

(表1)结果显示,MPP模型组血清MP-IgM和CRP水平较对照组显著升高(P<0.05)。此外,丙泊酚或阿奇霉素治疗后显著降低了MPP模型大鼠中MP-IgM和CRP的血清水平(P<0.05);而丙泊酚与阿奇霉素对MP-IgM和CRP水平的影响无统计学差异(P>0.05)。在使用渥曼青霉素干预后可明显逆转丙泊酚对MPP模型大鼠中MP-IgM和CRP的血清水平的抑制作用(P<0.05)。

表1 丙泊酚对MPP模型大鼠血清MP-IgM和CRP水平的影响

二、丙泊酚抑制MPP模型大鼠BALF的炎症反应

(表2)结果显示,与对照组比较,MPP模型组大鼠BALF中炎症因子IL-6、IL-18和TNF-α水平显著上调;另外嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞数量均明显增多(P<0.05)。与MPP模型组比较,丙泊酚组或阿奇霉素组大鼠BALF中炎症因子水平明显降低;此外,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞数量均明显减少(P<0.05)。与丙泊酚组比较,阿奇霉素组大鼠BALF中炎症因子水平变化以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞数量变化无显著差异(P>0.05):而丙泊酚+渥曼青霉素组大鼠BALF中炎症因子水平以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞数量明显增加(P<0.05)。

表2 丙泊酚对MPP模型大鼠BALF中炎症因子水平和炎症细胞数量的影响

三、丙泊酚改善MPP模型大鼠肺组织损伤

(表3)结果显示,MPP模型组大鼠肺湿干比较对照组明显上调(P<0.05);相比之下,与MPP模型组比较,丙泊酚组或阿奇霉素组显著降低大鼠肺湿干比(P<0.05);此外,丙泊酚对大鼠肺湿干比的抑制作用可被渥曼青霉素减弱(P<0.05)。

表3 丙泊酚对MPP模型大鼠肺湿干比以及肺组织病理性损伤的影响

HE染色结果显示,对照组支气管、肺泡和血管未见明显病变,肺泡壁未见明显异常,肺组织未见炎症细胞浸润;而MPP模型组大鼠肺泡结构较松散,肺泡壁因水肿而增厚,肺组织出现大量炎症细胞浸润;相比于MPP模型组,丙泊酚组或阿奇霉素组肺泡结构和肺组织壁增厚显著减少,炎症细胞浸润减少(见图1)。然而,丙泊酚对肺组织病理损伤的积极作用被渥曼青霉素阻断。此外,根据炎症浸润评分标准评估肺组织损伤,与对照组比较,MPP模型组大鼠炎症浸润评分明显升高(P<0.05);与MPP模型组比较,丙泊酚组或阿奇霉素组大鼠炎症浸润评分显著下调(P<0.05);与丙泊酚组比较,阿奇霉素组大鼠炎症浸润评分变化无显著差异(P>0.05),丙泊酚+渥曼青霉素组大鼠炎症浸润评分显著增加(P<0.05)。

图1 HE染色检测丙泊酚对MPP模型大鼠肺组织病理性损伤的影响(×200,箭头表示炎性细胞浸润)

四、丙泊酚抑制MPP模型大鼠肺组织细胞凋亡

(图2和表4)结果显示,与对照组比较,MPP模型组肺组织中TUNEL阳性细胞数量明显增加,细胞凋亡率升高(P<0.05);与MPP模型组比较,丙泊酚组或阿奇霉素组TUNEL阳性细胞数量明显减少,细胞凋亡率降低(P<0.05);与丙泊酚组比较,阿奇霉素组细胞凋亡率变化无显著差异(P>0.05);丙泊酚+渥曼青霉素组TUNEL阳性细胞数量明显增多,细胞凋亡率升高(P<0.05)。

图2 TUNEL染色检测丙泊酚对MPP模型大鼠肺组织细胞凋亡的影响(×400)

表4 丙泊酚对MPP模型大鼠肺组织细胞凋亡的影响

五、丙泊酚激活MPP模型大鼠中PI3K/Akt信号通路

(图3和表5)结果显示,与对照组比较,MPP模型组肺组织中磷酸化的PI3K和Akt蛋白相对水平明显降低(P<0.05);与MPP模型组比较,丙泊酚组或阿奇霉素组磷酸化的PI3K和Akt蛋白相对水平明显升高(P<0.05);与丙泊酚组比较,阿奇霉素组磷酸化的PI3K和Akt蛋白相对水平变化无显著差异(P>0.05),而丙泊酚+渥曼青霉素组磷酸化的PI3K和Akt蛋白相对水平明显降低(P<0.05)。

图3 Western Blot检测丙泊酚对MPP模型大鼠肺组织PI3K/Akt信号通路的影响1～5依次表示为对照组、MPP模型组、丙泊酚组、阿奇霉素组和丙泊酚+渥曼青霉素组

表5 丙泊酚对MPP模型大鼠肺组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值的影响

讨 论

MPP是一种儿童常见的呼吸道疾病,其发病率正在逐渐增加[12]。MP是一种最小、最简单的自我复制细菌,无细胞壁,其生存依赖于宿主的营养交换。MP侵入人体后可通过与宿主细胞膜融合诱导机体免疫反应[13]。随着对MPP的不断研究,多种包含阿奇霉素等大环内酯类药物可用作一线治疗药物,但由于耐药导致治疗效果有限,并且单独使用阿奇霉素治疗还可诱发难治性的MPP[14]。因此,寻找MPP的理想治疗方案尤为关键。

MP特异性IgM的鉴定是临床上用于诊断MP感染的广泛指标[15]。本研究显示,丙泊酚后可明显降低MPP大鼠MP-IgM水平,提示丙泊酚抑制MP生长。另外,CRP不仅是一种急性期反应蛋白,也是一种促炎因子,在机体发生炎症反应或感染时高表达,也是诊断MPP发生的关键性指标之一[16-17]。结果显示,丙泊酚降低了MP感染诱发的血清中CRP的高表达。现有的研究和报告显示,IL-6等炎性因子是CRP合成的主要因素[18]。以上这些炎症已被证实在MPP中高表达,且与多种自身免疫性疾病和炎症性疾病相关。于是,本研究检测了用或不用丙泊酚处理的MPP大鼠BALF中炎症因子的水平和炎症细胞的数量以探究丙泊酚与MPP大鼠炎症反应之间的关系。结果表明,丙泊酚不仅减少了MPP大鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞数量,并且降低了IL-6、IL-18和TNF-α水平。提示丙泊酚通过减少炎症细胞的浸润改善MP诱发的炎症反应。进一步表明,丙泊酚减轻了MPP大鼠肺组织的病理损伤,降低了MPP大鼠肺组织中细胞凋亡率。以上结果表明,丙泊酚保护MP感染的大鼠免受炎症和细胞凋亡损伤,然而其机制尚不明晰。

既往研究表明,PI3K/Akt信号通路在炎症细胞募集、调节炎症介质的表达以及气道重塑等多种机体活动中发挥着至关重要的作用[19]。据报道,激活PI3K/Akt信号可通过抑制炎症和纤维化的发生发挥心脏保护作用[20]。另外,线粒体ATP敏感性钾离子通道通过激活哮喘大鼠模型中PI3K/Akt信号通路增加气道平滑肌细胞增殖[21]。为阐明PI3K/Akt通路激活是否参与丙泊酚对MP感染所致的肺损伤的保护作用。本研究通过检测PI3K和Akt磷酸化水平发现,丙泊酚可上调MPP模型大鼠肺组织中PI3K和Akt磷酸化水平;而在使用PI3K抑制剂渥曼青霉素处理后不仅抑制了丙泊酚对PI3K和Akt磷酸化水平的促进作用,并且削弱了丙泊酚对MPP大鼠的保护作用。以上这些结果表明,PI3K/Akt通路参与了丙泊酚对MP诱导的肺损伤的保护作用。

综上,丙泊酚能够通过下调血清MP-IgM和CRP水平、抑制BALF中炎症因子水平和减少炎症细胞数量、同时削弱肺组织的炎症浸润和病理变化以及抑制细胞凋亡改善MP所致的肺损伤。值得注意的是,丙泊酚的这些保护特性可以通过激活PI3K/Akt信号通路来实现。然而,本研究还存在一些局限性,首先,渥曼青霉素只能部分逆转丙泊酚的保护作用,表明除了PI3K/Akt通路,丙泊酚可能还存在其他保护机制;其次,仅使用了渥曼青霉素研究了PI3K/Akt信号通路在当前研究中的作用,而PI3K或Akt基因敲除模型或RNA干扰技术也可考虑应用于进一步研究,这将有利于证明此通路在丙泊酚保护MP诱导的肺损伤中的具体作用。