油菜水浸提液自毒作用的研究

石丹妮，冯煜琳，常 静，李睿光，高玉莲，李海平

（内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，内蒙古呼和浩特 010011）

油菜是我国播种面积最大的油料作物，每年大约能提供50%的国产植物油[1-2]。油菜受气候条件、土壤结构等自然条件影响，各地区种植模式差异很大，主要分为北方春油菜区和南方冬油菜区。春油菜主要分布在我国西部的高海拔地区，如青海、新疆等地；北部的高纬度地区，如内蒙古、黑龙江等地；二熟复种地区；种植面积能达到全国油菜的1/10左右[3-4]。内蒙古是春油菜的主要种植地之一，独特的地理条件和气候特征使该地区的产油菜籽含油量较丰富、亚油酸含量较高，因此油菜品质优异，市场需求量较大。但随着油菜需求的增大和种植年限的增加，油菜出苗率降低、产量下降、连作障碍问题比较突出，成为制约内蒙古油菜可持续发展的重要因素之一。

自毒作用属于一种特殊的化感作用，是造成农作物连作障碍的主要因素之一[5]。植物在生长发育中会产生残根、落叶、枝条等组织，这些组织经淋溶等作用方式进入土壤后释放化感物质，会对邻近或者下茬植物产生影响，这种影响可以是间接的也可以是直接的。自毒作用是一种发生在种内的生长抑制作用，是植物生存竞争的特殊形式。农作物会因自毒作用而产生连作障碍[6-8]。自毒作用可从多个方面影响农作物的生长和发育，如细胞膜的酶活性、离子吸收和光合作用等，因此，物理措施不能很好地解决自毒作用对植物连作产生的消极影响。

油菜是一种重要的油料作物，同时也是一种重要的绿肥资源。多项研究表明，油菜作为绿肥或上茬作物，对多种农作物具有化感作用[9-11]。但关于油菜连作及自毒作用的研究，目前报道很少。因此，本试验研究了油菜水浸提液对油菜种子萌发及幼苗生长的影响，以及对油菜体内防御酶和主要物质的影响，旨在为探究油菜的自毒作用及未来油菜的可持续发展提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选用内蒙古呼和浩特市武川县主要种植品种大黄油菜（Brassica napus L.）。

1.2 试验方法

1.2.1 油菜水浸提液的制备

油菜在室内盆栽种植，将油菜种子放入装有500 g土的花盆中，置于育苗室，待油菜成熟除去籽粒全株收获。用液氮将油菜冰冻并粉碎成粉末状，称取20 g油菜粉末置于烧杯中，同时烧杯中加入150 mL蒸馏水，用玻璃棒充分搅匀，最后定容至200 mL。48 h后即得到0.100 g/mL油菜水浸提液，再用蒸馏水配制0.050 g/mL和0.025 g/mL的油菜水浸提液。以蒸馏水为对照，设置0.025、0.050、0.100 g/mL 3个浓度的油菜水浸提液。

1.2.2 油菜水浸提液对油菜种子发芽的影响

选取籽粒饱满的油菜种子，用乙醇和次氯酸钠消毒，根据曾任森[12]的方法测定种子萌发情况。将滤纸放入直径12 cm的培养皿中，每皿放入30粒种子，根据预试验结果，每个培养皿中加入20 mL不同浓度油菜水浸提液，对照加入等量蒸馏水。在人工气候箱中进行培养，定期补充同量的水分。每个浓度处理300粒种子，3次重复。油菜种子发芽的温度为（25±1）℃，萌发时间7 d。每天记录发芽数量，计算发芽率、发芽势、发芽指数（GI）及活力指数（VI）[13]。

式中，S为种苗生长量（长度或重量）。

数据统计分析采用 RICHARDSON[14]提出的化感效应检验方法，即

式中，C为对照值；T为处理值；RI为化感作用效应，RI＞0为促进，RI＜0为抑制，绝对值的大小表示作用强度大小。

化感综合效应指数反映化感效应的强弱，是指茎长、根长、发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数化感效应指数的加权平均值。

1.2.3 油菜水浸提液对油菜幼苗生长的影响

选取直径20 cm的花盆，每个花盆加入土壤500 g，选取大小相似的油菜种子，均匀地摆放在花盆内，每盆种植10粒，每10盆为1个处理，3次重复。将3个浓度的油菜水浸提液快速搅拌后分别浇入花盆，每盆300 mL，之后在花盆表面覆上干土，每天适量在每个花盆里补充等量水分。以蒸馏水作为对照。油菜幼苗生长至第7天，每个浓度取10株幼苗，测定茎长、根长，计算平均值。茎长从根和茎的交点测到幼苗生长点，根长从根茎交点测到主根的一端。每个浓度重复3次。

1.2.4 油菜水浸提液对幼苗营养物质和防御酶活性的影响

取发芽后7 d的油菜叶片，在研钵中冰浴下研磨，加入提取介质离心后，取上清液即为所需酶液。可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250法[15]测定。过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性分别采用愈创木酚法和NBT法测定，脯氨酸含量和过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外吸收法[16]测定。丙二醛（MDA）含量参照高俊凤[17]的方法。

1.3 数据处理与分析

数据采用Excel 2016软件进行统计处理，采用ANOVA方法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 油菜水浸提液对油菜种子发芽的影响

由表1可知，当油菜水浸提液浓度为0.025 g/mL时，油菜种子发芽率﹑发芽势﹑发芽指数和活力指数4个指标值均大于对照，但与对照无显著差异（P>0.05）。当油菜水浸提液浓度为0.100 g/mL时，4个指标值均显著小于对照（P<0.05）。浓度为0.050 g/mL时，发芽率显著低于对照（P<0.05）；其余3个指标低于对照，但无显著差异（P>0.05）。

表1 油菜水浸提液对油菜种子萌发的影响Table 1 Effect of canola water extract on seed germination of canola

2.2 油菜水浸提液对油菜幼苗茎长、根长的影响

由表2可知，在油菜水浸提液浓度为0.025 g/mL时，油菜茎长表现为促进作用，随着油菜水浸提液浓度的升高油菜茎长表现为抑制作用，抑制率在0.100 g/mL达到最大。各浓度下油菜根长均表现为抑制作用，0.100 g/mL浓度时抑制率最大，抑制作用最强。

表2 不同浓度油菜水浸提液对油菜茎长、根长的影响Table 2 Effects of different concentrations of canola water extract on canola stem and root length

2.3 油菜水浸提液对油菜的化感综合效应

根据油菜水浸提液3个浓度处理后油菜发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、幼苗根长和茎长6个指标的化感效应指数，计算化感综合效应（表3）。随着油菜浸提液浓度增加，油菜的化感效应呈“低促高抑”，但总体呈现抑制现象。当浓度为0.100 g/mL时，油菜化感综合效应指数最大，抑制作用最强。

表3 不同浓度油菜水浸液对油菜的化感综合效应Table 3 Different concentrations of canola water extract on canola allelopathic comprehensive effects

2.4 油菜水浸提液对油菜蛋白质和脯氨酸含量的影响

由图1可知，当油菜水浸提液浓度为0.100 g/mL时，油菜的蛋白质含量显著低于对照（P<0.05），其余浓度的蛋白质含量与对照相比无显著差异（P>0.05）。各浓度下油菜的脯氨酸含量均显著高于对照（P<0.05），在0.050 g/mL时油菜的脯氨酸含量较对照高115.39%。

图1 不同浓度油菜水浸提液对油菜蛋白质和脯氨酸含量的影响Figure 1 Effect of different canola water extract concentrations on canola protein and proline contents

2.5 油菜水浸提液对油菜3种防御酶活性的影响

由表4可知，随着油菜水浸提液浓度的升高，SOD活性降低，均显著低于对照；在0.100 g/mL时油菜的SOD活性最低，为362.45 mmol/g。当油菜水浸提液浓度在0.025 g/mL时，POD活性显著高于对照（P<0.05）。各浓度处理下的CAT活性均高于对照，但与对照无显著差异（P>0.05）。

表4 不同浓度油菜水浸提液对油菜3种防御酶活性的影响Table 4 Effects of different canola water extract concentrations on three defect enzyme activities of canola

2.6 油菜水浸提液对油菜丙二醛含量的影响

由图2可知，不同浓度油菜水浸提液下油菜丙二醛（MDA）含量变化不同。0.100 g/mL油菜水浸提液下油菜的MDA含量显著高于对照（P<0.05）；0.050 g/mL油菜水浸提液下油菜的MDA含量显著低于对照（P<0.05）；0.025 g/mL油菜水浸提液下油菜的MDA含量高于对照，但与对照无显著差异（P>0.05）。

图2 不同浓度油菜水浸提液对油菜丙二醛含量的影响Figure 2 Effects of different canola water extract concentrations on canola MDA content

3 讨论与结论

化感作用是指当化感物质积累到一定量时会抑制植物的生长，但低于这个量会对植物表现为促进作用。种子萌发是植物生长的第一步，多项研究表明，植物的自毒作用首先会影响种子发芽[18]。YANG等[19]在研究胡麻残茬水提液对胡麻的自毒作用时发现，胡麻不同部位残茬水提液对胡麻种子萌发有“低促高抑”的作用。连作三七会对三七种子萌发产生抑制，抑制效果与种植时间有关[20]。王园园等[21]研究发现，谷子茎秆水浸提液会抑制谷子种子的萌发。醉马草对醉马草本身种子发芽的抑制作用强于其他植物[22]。本试验中，油菜水浸提液对油菜种子的发芽率和发芽势在低浓度时有一定的促进作用，但与对照无显著差异，浓度增大表现为抑制作用，抑制作用会随着浓度增大而增强，说明油菜水浸提液不利于油菜种子的萌发。

化感作用使植物释放的化感物质在环境和土壤中聚集，当含量达到一定水平时影响周围植物的种子萌发和幼苗生长[23]。植物幼苗也会受到化感作用的影响。王园园等[21]研究发现，谷子茎秆浸提液高浓度下会对谷子幼苗产生抑制。油菜浸提液对油菜根长有抑制作用，对茎整体表现为“低促高抑”，对根的抑制大于茎。有研究表明，植物根部对化感物质的反应更敏感[24]。根据这些结论推断，油菜水浸提液直接接触根，所以对油菜根产生的影响大；而茎是化感物质通过空气间接接触浸提液，所以茎表现为“低促高抑”。

蛋白质是生物生命活动的体现者，可溶性蛋白质含量可以体现出植物总代谢的水平[24]。王玉芝[25]研究蒿属植物时发现，高浓度的浸提液会影响植物体内的物质运输以及分解代谢，从而影响植物种子萌发和幼苗生长。本试验中，油菜水浸提液在中低浓度时，油菜幼苗蛋白质含量没有显著变化，而在高浓度时显著降低。高浓度的油菜水浸提液化感作用强，因此不利于营养物质的积累，所以油菜幼苗蛋白质含量低。脯氨酸是植物体内蛋白质的组成成分之一，在植物体内游离分布。脯氨酸水合能力强，可提高植物在应对不良环境时的抗性，在渗透调节方面起着重要作用[26-27]；脯氨酸还可以清除植物体内活性氧，保护细胞膜[28]。植物在不良环境条件下会使其体内的脯氨酸堆积，因此游离脯氨酸含量可作为植物抗逆性指标[29]。黄钰芳等[30]研究兰州百合根和鳞茎水浸液的自毒作用时发现，根的水浸液浓度大于100 mg/mL显著增加脯氨酸含量。本试验中，中低浓度油菜水浸提液显著提高脯氨酸含量，浓度升高则脯氨酸含量降低。油菜对油菜水浸提液不同浓度有不同的适应调节能力，高浓度时，植物自身调节能力下降，油菜无法调节其生理活动，油菜自毒作用增强。

植物体内防御酶活性的强弱可以反映植物的自我解毒能力，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）组成的防御酶系统能够增强防御酶的活性，从而清除植物体内的活性氧，降低活性氧积累对植物造成的不良影响[31]。鲍红春等[32]研究沙芥的自毒作用时发现，随着浸提液浓度增加，SOD和POD活性降低，CAT活性先上升后降低。本试验中，油菜SOD活性经浸提液处理后显著低于对照，POD活性在0.025 g/mL时显著升高，CAT活性与对照无显著差异。这说明在油菜自毒作用中，SOD活性受影响较大，而另外两个防御酶相关性较小。逆境下植物会发生膜脂过氧化，其产物MDA对细胞膜产生损害，影响植物生长，因此MDA含量的多少可以指示出植物受损的强弱[33]。本试验发现，经油菜水浸提液处理后，不同浓度处理下油菜MDA含量变化不同，说明油菜体内膜脂过氧化产物MDA含量变化比较复杂，还需要进一步研究。

研究表明，油菜产生的化感物质以挥发性的水溶性成分为主，如硫代葡萄糖苷、芥子酸等[34-35]。硫代葡萄糖苷是油菜等芸薹属植物特有的次生代谢产物，水解产生的异硫氰酸酯（ITCs）对土壤中的许多生物有控制作用，例如细菌、杂草、害虫等[36-37]，这也是油菜作为绿肥植物的重要特征。近年来随着研究的深入，油菜除作为油料作物外，在绿肥、饲料等其他方面也具有广阔的应用前景[38]。因此，油菜的用途越来越广，种植面积和范围不断扩大。研究油菜的自毒作用及其机制，对未来合理种植油菜，解决油菜连作障碍有重要的实践指导意义。