响应面法优化柚子皮总黄酮提取工艺

郭 诗，王星宇，郭佳妮，彭馨睿，朱慧楠，廖明星，缪园欣

（1.荆楚理工学院 农业生物技术研究所，湖北 荆门 448000；2.湖北省荆门市畜牧兽医局，湖北 荆门 448000）

柚子（Citrus grandis L.）是芸香科柑橘属植物，具有润肺、清肠、健脾胃等功效[1]，其营养丰富，富含糖类、维生素、类黄酮等营养成分[2-5]。柚子皮是柚子的重要副产物，约占鲜果重的20%～50%，富含果胶[6]、纤维素[7]、柚皮苷、柚皮芸香苷[8]、黄酮类化合物[9]。对柚子皮的功效进行研究发现，其具有降脂、抗氧化、杀菌消炎等药用功效[10-11]。目前，柚子皮主要用于制作蜜饯、饮品及肥料，或作为废弃物丢弃[12]。柚子皮中活性成分含量较高，可作为果胶、多酚、多糖等提取的理想原料[13]。有研究证实可通过纤维素酶辅助法、超声波法、微波消解法等对柚子皮中的功能性成分进行提取。

黄酮类物质是光合作用产生的天然抗氧化剂，具有降糖、降脂、抗肿瘤、抗过敏等生物活性[14-17]，广泛应用于医药领域。以柚子皮为原料进行黄酮提取，既可以合理利用柚子皮来增加经济效益，又可以生产出更多的黄酮类物质应用于医药领域。黄酮类物质抗氧化效应和药用价值显著，对人体健康具有重要的作用。能够提取黄酮的植物种类很多，但不同植物的黄酮含量有较大的差异，目前，植物黄酮的提取主要集中在银杏叶、刺梨等，以柚子皮等水果副产物作为黄酮提取来源相对较少。本试验以柚子皮为原料进行黄酮提取，并通过单因素试验得到料液比、乙醇浓度、超声时间和微波时间4个因素的优水平，然后采用响应面法对柚子皮黄酮的超声-微波辅助提取工艺进行优化，旨在为工业化提取柚子皮黄酮物质提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

新鲜成熟柚子：市售，芸香叶苷（芦丁）：北京索莱宝科技有限公司，亚硝酸钠：天津市福晨化学试剂厂，氢氧化钠：天津市福晨化学试剂厂，硝酸铝：天津市耀华化工厂，95%乙醇（分析纯）：武汉市洪山中南化工试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

101-2A型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司，TU-1901紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司，SB25-12D型超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司，微波炉：广东格兰仕微波生活电器制造有限公司，破壁机：九阳股份有限公司，FA224C型电子分析天平：上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料处理

取新鲜、无腐烂柚子皮洗净后切成小块，置于60℃烘干箱中烘干，随后用万能粉碎机对其进行粉碎并过380滋m筛子得到柚子皮粉，粉碎好的柚子皮粉密封装瓶于4℃保存备用。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制

于105℃烘箱中将芦丁标准品干燥至恒重，随后称取20 mg置于100 mL容量瓶中，加入60%乙醇将其完全溶解并定容至刻度，配制成浓度0.2 mg/mL的芦丁标准液。分别量取芦丁标准液 0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5 mL于25 mL的具塞刻度试管中，向试管中分别加入1 mL 5%的NaNO2摇匀，静置7 min。加入1 mL 10%的Al（NO3）3溶液，摇匀静置7 min。加入10 mL 1 mol/L的NaOH溶液，摇匀静置12 min后用60%乙醇定容至刻度，静置10 min。最后，在510 nm波长处测得吸光度。以芦丁标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线[18]。

1.3.3 柚子皮总黄酮的测定

精密称取柚子皮粉1.000 g，按不同的料液比加入不同浓度乙醇，超声-微波协同提取一定时间。提取完成后浓缩至20 mL，再用60%乙醇定容至50 mL得到总黄酮提取液，按1.3.2的方法操作测得总黄酮浓度，并依据下列公式计算得出总黄酮提取率。

式中，C为柚子皮样品中总黄酮的浓度（mg/mL）；V为样品溶液稀释液体积（mL）；N为稀释倍数；m为样品质量（g）。

1.3.4 柚子皮总黄酮提取工艺优化试验

1.3.4.1 料液比对总黄酮提取率的影响

准确称取 1.000 g样品，分别按 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL）的料液比加入 70%的乙醇，超声处理20 min，再在350 W微波功率下提取1.5 min。提取结束后浓缩、定容，测定吸光度，并计算柚子皮总黄酮得率。

1.3.4.2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

准确称取 1.000 g 样品，按 1∶20（g∶mL）的料液比分别加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，超声处理20 min，再在350 W微波功率下提取1.5 min。提取结束后浓缩、定容，测定吸光度，并计算柚子皮总黄酮得率。

1.3.4.3 超声时间对总黄酮提取率的影响

准确称取 1.000 g 样品，按 1∶20（g∶mL）的料液比加入80%的乙醇，分别超声处理10、15、20、25、30 min，再在350W微波功率下提取1.5 min。提取结束后浓缩、定容，测定吸光度，并计算柚子皮总黄酮得率。

1.3.4.4 微波时间对总黄酮提取率的影响

准确称取 1.000 g 样品，按 1∶20（g∶mL）的料液比加入80%的乙醇，超声处理15 min，再在350 W微波功率下提取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 min。提取结束后浓缩、定容，测定吸光度，并计算柚子皮总黄酮得率。

1.3.5 响应面优化试验

根据Box-Behnken试验设计原理，选择4个单因素：料液比（A）、乙醇浓度（B）、微波时间（C）和微波时间（D）为变量，建立响应曲面回归模型，以总黄酮得率（Y）为响应值，按照4因素3水平进行响应曲面法试验。响应曲面试验设计因素水平见表1。

表1 响应曲面试验设计因素水平Table 1 Response surface test designed factor level

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

以芦丁标准液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制芦丁标准曲线（图1）。

图1 芦丁标准曲线Figure 1 Standard curve of rutin

根据图1求得回归方程y=9.434x-0.012，相关系数R2为0.999，表明在该浓度范围内，芦丁浓度和吸光度值之间拟合情况良好，可以按照该方程计算柚子皮溶液中总黄酮含量。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 料液比对柚子皮总黄酮提取率的影响

由图2可知，在试验范围内，随着料液比的增加，柚子皮总黄酮提取率呈先上升后下降的趋势，在料液比为1∶20时，柚子皮总黄酮提取率达最大值，但当料液比超过1∶20时，柚子皮总黄酮提取率逐渐降低。因此，料液比 1∶20（g∶mL）是有利于总黄酮提取的最佳料液比。

图2 料液比对柚子皮总黄酮提取率的影响Figure 2 Effect of solid to liquid ratio on shaddock peel flavonoids extraction rate

2.2.2 乙醇浓度对柚子皮总黄酮提取率的影响

由图3可知，在试验范围内，随着乙醇浓度的逐渐增大，总黄酮提取率呈先上升后下降的趋势。当乙醇浓度为80%时，柚子皮黄酮具有较高的提取率。因此，乙醇浓度选择80%较为适宜。

图3 乙醇浓度对柚子皮总黄酮提取率的影响Figure 3 Effect of ethanol concentration on shaddock peel flavonoids extraction rate

2.2.3 超声时间对柚子皮总黄酮提取率的影响

由图4可知，超声时间在10～15 min范围内，随着超声时间的延长柚子皮总黄酮提取率逐渐增加；当超声时间超过15 min时，柚子皮黄酮的提取率开始降低。因此，柚子皮黄酮提取的最佳超声时间为15 min。

图4 超声时间对柚子皮总黄酮提取率的影响Figure 4 Effect of ultrasonic time on shaddock peel flavonoids extraction rate

2.2.4 微波时间对柚子皮总黄酮提取率的影响

由图5可知，微波时间在0.5～1.0 min范围内，随着微波时间的增加，柚子皮黄酮的提取率逐渐增加；当微波时间持续增加超过1.0 min后，总黄酮提取率降低。因此，微波时间1.0min为最佳微波时间。

图5 微波时间对柚子皮总黄酮提取率的影响Figure 5 Effect of microwave time on shaddock peel flavonoids extraction rate

2.3 响应面试验结果分析

根据Box-Behnken试验设计原理，选择4个因素，料液比（A）、乙醇浓度（B）、超声时间（C）和微波时间（D）为变量建立响应面回归模型，柚子皮总黄酮提取率（Y）为响应值。响应面分析试验方案及结果见表2，方差分析见表3。

表3 柚子皮总黄酮提取率的方差分析Table 3 Analysis of variance of shaddock peel flavonoids extraction rate

以柚子皮总黄酮提取率为响应值，进行多元二次回归拟合分析，得到多元二次响应面回归模型：Y=1.41+0.033A+0.0038B+0.096C-0.034D-0.017AB-0.01AC-0.018AD+0.00025BC-0.022BD+0.0005CD-0.093A2+0.022B2-0.14C2-0.066D2。

对表2中总黄酮提取率进行方差分析，其结果见表3。方差分析显著性检验结果显示，该回归模型P<0.01极显著，失拟项P=0.150>0.05不显著，表明该模型具有统计学意义。此外，模型复相关系数R2为0.935 8，修正复相关系数R2Adj为0.871 6，说明该模型能解释87.16%响应值的变化，因此使用该模型对柚子皮总黄酮提取工艺进行分析和优化是合适的。显著性分析结果显示，模型一次项C及模型二次项A2、C2、D2对柚子皮总黄酮提取率有极显著的影响（P<0.01），模型一次项A、D对柚子皮总黄酮提取率有显著的影响（P<0.05），交互作用项对柚子皮总黄酮提取率均没有显著影响。根据F值可知，4个因素对柚子皮总黄酮得率的影响顺序为超声时间（C）>微波时间（D）>料液比（A）>乙醇浓度（B）。

2.4 验证试验

运用Design Expert 10.0.3数据分析软件，结合模型得到最佳的柚子皮总黄酮提取工艺为料液比1∶20.61，乙醇浓度 89.81%，超声时间 16.17 min，微波时间0.688 min。在该工艺下，柚子皮总黄酮提取率的理论值为1.464%。在料液比1∶21，乙醇浓度90%，超声时间16 min，微波时间0.7 min条件下进行3次验证试验，结果显示，柚子皮总黄酮提取率平均值为1.457%，与预测值基本吻合。因此，选择该提取条件为其最佳工艺条件。

3 讨论与结论

本试验发现，柚子皮黄酮随料液比的增加呈现先增加后降低的趋势。在料液比较低时，随着乙醇浓度的增加，样品与溶剂在超声波和微波的作用下充分接触，黄酮较易析出。随着料液比超过1∶20，溶剂体积的不断增大，提取液受到超声-微波作用强度减弱，提取率逐渐降低[19]；而且柚子皮中总黄酮含量是有限的，溶剂体积过大或浓度过多，提取液浓度降低，阻碍柚子皮总黄酮的提取。

研究显示，乙醇是影响黄酮提取的重要因素。由于水的极性要强于乙醇，当乙醇浓度较低时，水含量高，低浓度乙醇溶液极性较大，随着乙醇浓度逐渐上升，乙醇溶剂的极性逐渐与柚子皮黄酮的极性接近，有利于柚子皮黄酮的溶出，因此一定范围内随着乙醇浓度的增加，总黄酮提取率呈上升趋势。但是乙醇浓度过高时，提取剂的极性减小，从而阻碍了一部分柚子皮黄酮的溶出，导致总黄酮提取率的降低[20]。此外，水可作为有机溶剂的传质剂，过高的乙醇浓度会使传质性降低，从而使提取率减小[21]。所以当乙醇浓度超过80%，总黄酮提取率呈下降的趋势。由于超声波的作用会使物质的细胞膜发生破裂，并能促进分子间的运动，因此，一定的超声波作用能够增加总黄酮提取率，超声时间在10～15 min范围内，随着超声时间的延长柚子皮总黄酮提取率逐渐增加。但是超声处理时间过长时，其热效应和空化效应对黄酮结构产生破坏，会增加杂质的溶出，导致提取率降低[15]；而超声时间太少则造成黄酮类物质溶解不充分，也会降低提取率，因此当超声时间超过15 min时，柚子皮黄酮的提取率开始降低。研究发现，适量微波处理，物质吸收微波能增加，有利于有效成分的溶出，柚子皮黄酮的提取率逐渐增加；微波时间在0.5～1.0 min范围内，随着微波时间的增加，柚子皮黄酮的提取率逐渐增加。当微波时间持续增加后，微波温度随着微波时间的增加而升高，使部分已溶出的总黄酮类物质挥发，导致有效成分出现损失，使总黄酮提取率降低。因此，当微波时间持续增加超过1.0 min后，总黄酮提取率降低。

在单因素试验的基础上，本试验采用Box-Behnken设计，对柚子皮总黄酮的超声-微波辅助提取工艺进行了优化，发现各单因素影响柚子皮总黄酮提取率的主次顺序为：超声时间>微波时间>料液比>乙醇浓度。通过对柚子皮总黄酮提取工艺参数的二次多项式回归模型进行优化，得到柚子皮总黄酮的最佳提取工艺参数为料液比1∶21，乙醇浓度90%，超声时间16 min，微波时间0.7 min，在该工艺条件下，柚子皮总黄酮的提取率为1.457%。