饲喂葛叶对豆天蛾幼虫生长性能及肠道菌群多样性的影响

谢洁微，李雪玲，施庆珊，吴俊松，朱剑锋，李锐明，胡文锋

（1.华南农业大学 食品学院，广东 广州 510642；2.广东省科学院 微生物研究所，广东 广州 510700；3.广州崧源农业科技有限公司，广东 广州 510640；4.生物源生物技术（深圳）股份有限公司，广东 深圳 518118）

豆天蛾（Clanis bilineata tingtauica），别名大豆天蛾，幼虫俗称“豆虫”，又称“豆丹”，属鳞翅目天蛾科云纹天蛾亚科豆天蛾属，常发生于豆类作物叶部，主要寄主包括大豆、刺槐、洋槐、藤萝及葛属、黧豆属等植物[1]。我国食用豆丹的习俗由来已久，蒲松龄的《农蚕经》就有记载，据考证，食用豆丹是苏北地区灌云县特有的饮食习惯[2]。随着人口的增加和生活水平的提高，肉、蛋、奶、豆等食品供给的蛋白质已不能满足人们对高质量蛋白质的需求[3]，而食用昆虫不仅养殖转化率高、繁殖速度快、耗能低，而且能提供丰富的蛋白质[4-6]。由于豆丹味道鲜美，富含高蛋白、维生素、微量元素，脂肪含量较低，因此在江苏灌云等地已成为地方的特色美食，是极具开发潜力的高质量蛋白资源[7]。

目前，人工养殖的豆丹主要以大豆叶为食，幼虫进入暴食期可将大豆叶吃光，最后导致大豆不能结荚[8]；大豆叶一旦被吃光则无法重新长出，若要满足幼虫采食，需重新种植大豆叶，而大豆重茬种植会导致植株生长迟缓、矮小、叶色变黄、易感染病虫害[9]。葛与大豆同属豆科，目前，人们对野葛的利用仍是以传统药用部位根部入药或制作葛粉为主，生产和收获时多将葛叶作为废弃物丢掉，不仅造成资源浪费，还会生污染态环境[10]。葛叶中含粗蛋白含量较高，并含有16种氨基酸、多种矿物元素（如钙、磷等）以及粗脂肪、粗纤维、维生素[11-13]和多种活性物质[14-16]，具有较高的饲用价值，已在猪、兔、羊等动物饲粮中应用，可在一定程度上提高动物的生长性能和养殖效益[17-20]，然而有关葛叶在食用昆虫饲粮中的应用未见报道。目前，关于豆天蛾幼虫的研究大多集中在营养价值和生物特性方面，在开发新型食料方面研究较少[21-24]。本试验以葛叶替代大豆叶饲喂豆天蛾幼虫，旨在探究葛叶对豆天蛾幼虫生长性能和肠道菌群多样性的影响。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用豆天蛾虫卵由河南省漯河市舞阳县太尉镇关寨村养殖基地提供。葛叶、大豆叶采自华南农业大学启林农训中心葛根研究院豆丹养殖基地。在葛叶与大豆叶生长期间不使用任何农药，及时除虫除草，保证葛叶和大豆叶无农药残留、无虫，每天现摘现用。

1.2 卵的孵化和幼虫饲养

挑选颜色均匀的虫卵，置于温度为28℃、相对湿度为55%的人工气候箱内进行孵化。挑选大小一致、活跃度相同的初孵幼虫（0日龄），分别用葛叶（试验组）和大豆叶（对照组）进行饲喂。每组设置3个重复，每个重复200头幼虫。

将带枝的葛叶和大豆叶分别放入装满水的离心管中，管口塞棉球以防漏水，每片叶子接上20头幼虫，并放在塑料透明养虫盒（24 cm×19 cm×10 cm）中，套上纱布再盖上盖子防止虫子逃出；后期幼虫迅速长大，养虫盒要保持合理的幼虫密度，防止幼虫因食料不足而自相残杀。每天更换新鲜叶子、清理和收集虫砂，饲喂持续至幼虫30日龄。试验期间每天早晚记录幼虫生长情况，及时挑出死亡幼虫，记录不同日龄幼虫的生长发育变化。将幼虫空腹处理24 h、在无菌条件下，解剖肠道、收集0、10、15、20和 25日龄豆天蛾幼虫肠道内容物约100 mg，用于分析检测其肠道菌群多样性差异。收集25日龄豆天蛾幼虫用于营养成分的测定分析。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 葛叶和大豆叶营养成分及含量

取试验基地种植的葛叶和大豆叶真空冷冻干燥至恒重、粉碎，测定叶子中水分含量，干重叶中粗蛋白、粗脂肪、灰分以及纤维素等营养成分含量。测定方法包括凯氏定氮法、索氏抽提法、灼烧法以及介质过滤法等。

1.3.2 豆天蛾幼虫生长发育指标

在饲喂的幼虫达到 0、5、10、15、20、25、30 日龄时分别从每个重复中随机挑取10头幼虫，用游标卡尺（精确至0.01 mm）测定幼虫的体长、体宽、头壳宽，并取平均值。用分析天平测定幼虫体重（精确至0.01 g）。试验期间，称量并计算幼虫的平均总摄食量和平均虫砂量，计算幼虫存活率、饲料转化率和料重比并记录每个幼虫龄期蜕皮时间。

1.3.3 豆天蛾幼虫营养成分及含量

试验结束后，取25日龄豆天蛾幼虫空腹24 h，60℃水浴漂烫150 s后冷却，真空冷冻干燥至恒重、粉碎，测定幼虫含水量、幼虫（干重）粗蛋白、粗脂肪以及灰分含量。

幼虫（干重）氨基酸测定采用美国产安捷伦Ag1100液相色谱仪，通过OPA FMOC柱前衍生化方法检测样品中17种氨基酸组分含量。采用ODS-HYPERSIL（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，柱温为40℃，流动相A为结晶乙酸钠、5%醋酸、四氢呋喃，流动相B为结晶乙酸钠、5%醋酸、乙腈、甲醇。

1.3.4 豆天蛾幼虫虫砂营养成分及含量

试验期间每天收集豆天蛾幼虫虫砂，置于105℃烘箱中烘干至恒重，将虫砂粉碎，测定虫砂含水量、虫砂（干重）粗蛋白、粗脂肪以及灰分含量。

1.3.5 幼虫肠道菌群组成差异分析

在无菌条件下，分别对 0、10、15、20、25 日龄豆天蛾幼虫进行24 h空腹处理。用75%的乙醇溶液将幼虫浸泡2 min，再用无菌水冲洗干净、吸干体表水分，在已灭菌的解剖台上，用无菌解剖剪将幼虫从尾部到头部剪开，用无菌注射器吸出肠道内容物约100 mg。采用CTAB法提取豆天蛾幼虫肠道微生物的DNA，然后进行16S rRNA基因测序，分析肠道菌群多样性。

1.4 数据统计及分析

采用Excel 2010软件进行数据处理，采用SPSS 19.0和Origin 23软件进行统计学分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 葛叶和大豆叶中的主要营养成分

由表1可知，葛叶中水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维及灰分含量均高于大豆叶，葛叶中水分比大豆叶高5.71%，粗蛋白含量比大豆叶高15.83%，粗纤维含量比大豆叶高47.08%，葛叶中水分、粗蛋白、粗纤维显著高于大豆叶（P<0.05），这与葛叶具有较好的持水性有较大关系。

表1 葛叶和大豆叶的营养成分及含量Table 1 The nutritive composition and content of Pueraria lobata leaf and soybean leaf

2.2 饲喂葛叶和大豆叶对豆天蛾幼虫生长发育的影响

2.2.1 对豆天蛾幼虫存活率、饲料转化率、料重比的影响

由表2可知，葛叶组豆天蛾幼虫存活率明显高于大豆叶组（P<0.05），分别为57.54%和43.03%，这说明与大豆叶相比，葛叶对豆天蛾幼虫无负面影响。相比大豆叶，葛叶组的饲料转化率更高，葛叶组料重比低于大豆叶组，表明葛叶更适合饲喂豆天蛾幼虫。为控制成本、经济利益最大化，在实际生产中需要高饲料转化率和低料重比，因此葛叶养殖豆天蛾幼虫具有较好的潜力。

表2 幼虫存活率、饲料转化率和料重比Table 2 The larval survival rate，digested feed conversion efficiency and gain to feed ratio

2.2.2 对豆天蛾幼虫生长性能的影响

由图1可知，试验期间两组处理豆天蛾幼虫生长指标的变化趋势相似，均在10～25日龄生长发育较好，且在10日龄以后葛叶组幼虫生长性能均优于大豆叶组，25～30日龄生长发育缓慢甚至停止。

图1 饲喂葛叶和大豆叶的豆天蛾幼虫平均体长（A）、平均体宽（B）、平均头壳宽（C）、平均体重（D）Figure 1The mean body length（A），mean body width（B），mean head capsule width（C），mean body weight（D）of Clanis bilineata tingtauica larvae fed with Pueraria lobata leaf and soybean leaf

0日龄豆天蛾幼虫的平均体长、平均体宽、平均头壳宽和平均体重分别为（7.96±0.27）mm、（1.57±0.07）mm、（1.65±0.03）mm 和（0.026±0.002）g，葛叶组25日龄幼虫的平均体长、平均体宽、平均头壳宽和平均体重分别为分别为（72.27±3.06）mm、（11.99±1.08）mm、（7.88±0.38）mm 和（7.34±0.32）g，其对比0日龄幼虫的增长率分别为807.91%、663.69%、377.58%和28 130.77%；大豆叶组25日龄幼虫的平均体长、平均体宽、平均头壳宽和平均体重分别为（67.61±2.56）mm、（10.82±0.74）mm、（7.62±0.39）mm 和（6.38±0.56）g，其对比 0 日龄幼虫的增长率分别为749.37%、589.17%、361.82%和24 438.46%。

由图1A可知，20日龄葛叶组的幼虫平均体长与大豆叶组存在显著差异（P<0.05）。由图1B可知，5日龄幼虫平均体宽增长缓慢，10日龄开始增长速度加快，但差异不显著（P＞0.05）；25日龄葛叶组幼虫平均体宽与大豆叶组存在显著差异（P<0.05）。由图1C可知，不同日龄，2个处理组幼虫平均头壳宽均无显著差异（P＞0.05）。由图1D可知，饲喂10 d后幼虫体重增长加快，且葛叶组不同日龄幼虫平均体重均高于大豆叶组，在15日龄和30日龄存在显著差异（P<0.05）；20～25日龄增长最快。

2.3 饲喂葛叶和大豆叶对豆天蛾幼虫营养成分及含量的影响

2.3.1 对豆天蛾幼虫含水量以及幼虫（干重）粗蛋白、粗脂肪、灰分含量的影响

由图2可知，葛叶组幼虫的粗蛋白、粗脂肪含量高于大豆叶组幼虫葛叶组粗蛋白含量为（64.12±0.23）%、大豆叶组粗蛋白含量为（63.80±0.99）%，葛叶组粗脂肪含量为（18.15±0.76）%、大豆叶组粗脂肪为（15.96±0.79）%，粗脂肪含量存在显著性差异（P<0.05）；葛叶组水分含量为（81.74±0.52）%、大豆叶组水分含量为（82.72±1.02）%，葛叶组灰分含量为（5.04±0.43）%、大豆叶组灰分含量为（5.99±0.69）%，葛叶组幼虫中水分含量和灰分含量低于大豆叶组，差异均不显著（P>0.05）。

图2 饲喂葛叶和大豆叶的豆天蛾幼虫营养成分及含量Figure 2 The nutritive composition and content of Canis bilineata tingtauica larvae fed with Pueraria lobata leaf and soybean leaf

2.3.2 对豆天蛾幼虫（干重）氨基酸组成及含量的影响

由表3可知，葛叶组和大豆叶组幼虫体内含量最高的氨基酸均为谷氨酸，分别为79.01和88.82 mg/g；含量最低的氨基酸均为半胱氨酸，分别为2.55和2.64 mg/g。除组氨酸、半胱氨酸和缬氨酸外，其他氨基酸在两组处理中均存在显著差异（P<0.05）。尽管葛叶组幼虫体内多种氨基酸含量低于大豆叶组，但是葛叶组幼虫体内必需氨基酸含量为212.7 mg/g，占总氨基酸比例为37.72%，略高于大豆叶组（37.18%）。

表3 饲喂葛叶和大豆叶的豆天蛾幼虫氨基酸含量Table 3 The amino acid content of Clanis bilineata tingtauica larvae fed with Pueraria lobata leaf and soybean leaf 单位：mg/g

2.4 饲喂葛叶和大豆叶对豆天蛾幼虫虫砂营养成分及含量的影响

由图3可知，幼虫虫砂中蛋白质含量较高，葛叶组为（21.33±0.14）%、大豆叶组为（22.40±0.36）%；葛叶组水分含量为（58.04±1.27）%、大豆叶组水分含量为（54.47±1.31）%；葛叶组灰分含量为（10.33±0.02）%、大豆叶组灰分含量为（9.23±0.02）%；粗脂肪含量为葛叶组（2.60±0.07）%、大豆叶组为（2.90±0.03）%。葛叶组虫砂水分和灰分含量均高于大豆叶组，粗蛋白与粗脂肪含量均低于大豆叶组，差异显著（P<0.05）。

图3 饲喂葛叶和大豆叶豆天蛾幼虫虫砂营养成分及含量Figure 3 The nutritive composition and content of frass of Clanis bilineata tingtauica larvae fed with Pueraria lobata leaf and soybean leaf

2.5 饲喂葛叶和大豆叶对豆天蛾幼虫肠道菌群多样性的影响

本试验采用16S rRNA测序技术，取0日龄幼虫和用葛叶和大豆叶饲养10、15、20、25 d的豆天蛾幼虫肠道样本，每个样本3次重复，对幼虫肠道菌群进行分析，经过测序，所有样品一共获得10 648条OTUs样本。

2.5.1 OTU-Venn分析

由图4可知，不同日龄的豆天蛾幼虫肠道共有4个OTUs，饲喂葛叶的豆天蛾幼虫肠道中，10日龄幼虫特有OTUs为188个，15日龄幼虫特有OTUs为100个，20日龄幼虫特有OTUs为169个，25日龄幼虫特有OTUs为2 621个；饲喂大豆叶的豆天蛾幼虫肠道中，10日龄幼虫特有OTUs为128个，15日龄幼虫特有OTUs为39个，20日龄幼虫特有OTUs为112个，25日龄幼虫特有OTUs为104个。表明葛叶和大豆叶对豆天蛾幼虫肠道细菌均有影响，且葛叶对豆天蛾幼虫肠道细菌的影响明显大于大豆叶。

图4 豆天蛾幼虫肠道菌群OTUsFigure 4 The OTUs of intestinal microflora of Clanis bilineata tingtauica larvae

2.5.2 豆天蛾幼虫肠道菌群在门分类水平上的微生物群落结构特征

由图5可知，幼虫肠道菌群在门水平分类上物种相对丰富度排名前10的菌门，包括厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、蓝菌门（Cyanobacteria）、疣微菌目（Verrucomicrobia）、互养菌门（Synergistetes）、栖热菌门（Thermi）、酸杆菌门（Acidobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi），其中物种相对丰富度大于1%的菌门依次为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门。B10～B25组中幼虫肠道菌群在门分类水平上物种组成多样性大于C10～C25组，即饲喂葛叶的幼虫肠道菌群具有更高的物种多样性。无论是饲喂葛叶还是大豆叶，随着时间的增加，幼虫肠道中厚壁菌门相对丰富度均先增加后减少，而在试验结束仍高于初始相对丰富度，其中15日龄比例最高，此时幼虫开始进入4龄期，即暴食期；其次0日龄幼虫肠道丰富度最高为变形菌门，饲喂过程中不同处理的幼虫肠道变形菌门呈现先减后增的现象，但至试验结束时仍低于初始相对丰富度。

图5 豆天蛾幼虫肠道菌群在门水平分类上的物种组成及相对丰富度Figure 5 Species composition and relative abundance of intestinal microflora of Clanis bilineata tingtauica larvae at the phylum level

由表4可知，除0日龄幼虫肠道样品中优势菌门为变形菌门（45.55%）外，分别饲喂葛叶、大豆叶的不同日龄幼虫肠道样品中优势菌门均为厚壁菌门，所占比例分别为 B10：75.96%、B15：78.73%、B20：54.38%、B25：45.37%、C10：85.48%、C15：96.99%、C20：96.99%、C25：89.69%。饲喂过程中，葛叶组幼虫肠道中厚壁菌门丰富度由最初的35.52%升高至45.37%，变形菌门由45.55%降至35.43%，放线菌门由原来的1.53%升高至4.95%，拟杆菌门由14.92%略降为12.17%，随着饲喂天数的延长，豆天蛾幼虫肠道内的优势菌门出现明显的变化。

表4 豆天蛾幼虫肠道菌群相对丰富度Top 4菌门的相对丰富度Table 4 The relative abundance of intestinal microflora of Clanis bilineata tingtauica larvae of Top 4 relative abundance at the phylum level 单位：%

2.5.3 豆天蛾幼虫肠道菌群在属分类水平上的微生物群落结构特征

由图6可知，从豆天蛾幼虫肠道样品中在属水平上丰富度排名前10的菌属分别是肠球菌属（Enterococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、代尔夫特菌属（Delftia）、巨单胞菌属（Megamonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、短状杆菌属（Brachybacterium）、拟杆菌属（Bacteroides）、颤螺旋菌属（Oscillospira）。

图6 豆天蛾幼虫肠道菌群在属水平分类上物种组成及相对丰富度Figure 6 Species composition and relative abundance of intestinal microflora of Clanis bilineata tingtauica larvae at the genus level

如表5所示，不同处理下，幼虫肠道中优势菌也不一样。其中，饲喂大豆叶的不同日龄幼虫肠道中优势菌属均为肠球菌属（Enterococcus），丰富度在85%以上，但菌属多样性较低，其他菌属丰富度与初始丰富度相比均明显降低，甚至未被检测到；饲喂葛叶的幼虫肠道样本中，20日龄幼虫肠道最大优势菌也是肠球菌属，而不同日龄幼虫肠道优势菌也不相同，饲喂25 d的幼虫肠道中厚壁菌门的肠球菌属均明显增加，葛叶组由初始丰富度0.05%提高至11.94%、大豆叶组提高至89.31%；厚壁菌门的葡萄球菌属相对丰富度在葛叶组中明显提高、在大豆叶组中略有所上升，由原来的0.12%分别提高至1.57%和0.15%。

表5 豆天蛾幼虫肠道菌群相对丰富度Top 10菌属的相对丰富度Table 5 The relative abundance of intestinal microflora of Clanis bilineata tingtauica larvae of Top 10 relative abundance at the genus level 单位：%

无论是饲喂葛叶还是大豆叶，幼虫肠道菌门菌属均发生了明显变化，且不同日龄的葛叶组幼虫肠道菌属组成相对丰富度均高于大豆叶组。采食葛叶的25日龄幼虫肠道物种组成与初始幼虫肠道较为相似，同多样性有所提高，如厚壁菌门的棒状杆菌属相对丰富度由初始的0.16%上升至19.82%。

总的来说，经过饲喂葛叶，25日龄豆天蛾幼虫肠道菌群多样性提高，特别是有益菌如巨单胞菌属、颤螺旋菌属。

3 讨论与结论

3.1 饲喂葛叶和大豆叶对生长发育的影响

试验期间，根据幼虫蜕皮情况及头壳等特征判断幼虫所处龄期，结果发现，0～5日龄幼虫处于1龄期，4～10日龄幼虫处于2龄期，9～18日龄幼虫处于3龄，16～24日龄幼虫出于4龄期，22～30日龄处于5龄期。

10日龄前幼虫生长发育较慢，这可能是因为此时幼虫处于1～2龄期，幼虫进食量较小，因此生长性能变化不明显。10日龄以后幼虫生长性能明显提高，这可能是因为10日龄以后幼虫开始进入3龄期，摄食量增加；幼虫平均体重在20～25日龄急剧上升，这可能是由于幼虫进入4龄期，即暴食期，摄食量达到最大，约为整个幼虫期摄食量的90%，这与冯雨艳等[25]研究结果相似。幼虫在25～30日龄缓慢甚至停止增长，这可能是因为幼虫开始进入老熟幼虫阶段，停止摄食、准备入土化蛹，因此作为商品虫，在25日龄收虫为宜。此外，10日龄以后葛叶组幼虫生长性能均高于大豆叶组，这可能是由于葛叶持水性、适口性均较大豆叶好，提高幼虫采食量。

3.2 饲喂葛叶和大豆叶对幼虫主要营养成分和氨基酸含量的影响

试验结果中，葛叶组粗蛋白含量略高于大豆叶组，分别为（64.12±0.23）%和（63.80±0.99）%，明显高于鸡蛋（49.24%）、牛奶（26.13%）和大豆（40.42%）等蛋白质来源，这与夏振军等[26]、Gao 等[27]、田华等[28]、吴胜军等[29]研究结果相似；试验结果表明，幼虫富含氨基酸，包括人体8种必需氨基酸，尽管葛叶组幼虫中多种氨基酸含量低于大豆叶组，而必需氨基酸占氨基酸总量比例中葛叶组高于大豆叶组。葛叶组幼虫粗脂肪含量高于大豆叶组，这可能是由于葛叶中粗蛋白和粗脂肪含量均高于大豆叶。试验发现，25日龄幼虫干重中的粗蛋白、粗脂肪含量均高于叶子中的含量，这说明豆天蛾幼虫具有合成蛋白质和脂肪的作用。幼虫虫砂具有特殊的芳香气味，且蛋白质含量均达20%以上。“蚕砂”是一种特色的产品，豆天蛾幼虫以无药无害的植物为食，其虫砂营养丰富，也可变废为宝，开发为类似于“蚕砂”的新产品[30]。

3.3 饲喂葛叶和大豆叶对幼虫肠道菌群的影响

试验结果表明，幼虫在10日龄以后生长性能的特征较明显，可能是由于10日龄以后肠道菌群变化差异较大，因此试验采用了第0天、第10天、第15天、第20天、第25天幼虫肠道作为样品。葛叶组豆天蛾幼虫肠道菌群种类丰富度均高于大豆叶组，这可能也是葛叶组幼虫生长性能优于大豆叶组的原因之一。采食大豆叶的不同日龄幼虫肠道中优势菌属均为肠球菌属[7]，葛叶组中幼虫肠道肠球菌属、葡萄球菌属外，还具有巨单胞菌属、颤螺旋菌属等有益菌，说明不同食料对幼虫肠道菌群产生影响[31]。除葛叶组25日龄幼虫外，其他样品中幼虫肠道菌群种类较0日龄幼虫有所降低，这可能是因为采食后肠道中优势菌群逐渐充斥初孵幼虫肠道菌群。与其他样品相比，25日龄葛叶幼虫肠道菌属丰富度及比例相对较高，这可能也解释了25日龄幼虫摄食量达到最大且葛叶组幼虫生长性能优于大豆叶组的现象。

采食葛叶的豆天蛾幼虫，具有更高的存活率和饲料转化率、更低的料重比、更优的生长指标；幼虫干重中的粗脂肪、粗蛋白含量以及必需氨基酸占比更高；肠道菌群多样性更丰富。因此，采用葛叶代替大豆叶喂养豆天蛾幼虫可以促进幼虫生长发育、改善幼虫肠道微生态环境，提高幼虫品质和经济效益。