不同质量分数生长素对Cd胁迫的香樟幼苗生理生化特性的影响1)

张泽锟 张辰阳 汪洋 艾艳梅 徐晓阳 冯今萍 洪婉悦 宋兰萍

(皖江流域退化生态系统的恢复与重建省部共建协同创新中心(安徽师范大学),芜湖,241002)

李小平 周际海

(南方现代林业协同创新中心(南京林业大学)(皖江流域退化生态系统的恢复与重建省部共建协同创新中心(安徽师范大学))

随着工农业的不断发展,重金属污染日趋严重[1]。2014年《全国土壤污染状况调查公报》指出,我国耕地土壤环境质量较差,部分地区已存在严重的重金属污染问题,全国土壤重金属总超标率为16.1%[2]。农业部门针对全国农田土壤重金属污染状况进行了调查,印发了《农产品产地重金属污染防治实施方案》。但截至目前,农田土壤重金属污染防治工作仍未取得实质性进展[3]。有研究表明,重金属元素进入土壤后,会产生明显的生物效应,土壤被重金属污染后,通过土壤-农作物-人、土壤-植物-动物-人、土壤-水-人等食物链形式影响人体健康,引发疾病甚至导致死亡[4-5]。因此,对重金属污染土壤进行修复十分必要。

重金属污染土壤修复包括植物修复、工程治理、化学修复。其中,工程修复工程量大、成本高,不适用于大面积污染的土壤改良,且对污染土壤处理不当又会造成新的污染;化学修复主要包括化学固定、螯合萃取、氧化还原等方法[6-7],大量使用会限制植物生长;植物修复技术作为迅速成长的绿色生态技术,修复效果好且易操作,适用于各种土壤类型。植物修复技术不仅具有投入费用较低、治理效果显著的优点,同时兼具较高的研究和应用价值,甚至可以利用修复土壤的植物创造一定的经济效益,是重金属土壤污染修复的重要手段[8]。目前,植物修复材料大多为草本植物,而采用生物量较大的木本植物作为植物修复材料的相关研究较少。

香樟(CinnamomumcamphoraL.)是中国亚热带阔叶林中的重要树种,为常绿乔木,主要分布于我国长江流域以南各省。目前,对香樟的研究和开发应用涵盖植物学、生态学、环境科学、水土保持学、农学、林学、药学等众多学科,并将成为21世纪较有价值的生态工程技术之一。现阶段,关于香樟对矿区污染土壤中污染物富集的影响已有初步研究[9-12],如周际海等[13]发现,香樟叶片的净光合速率、叶绿素、渗透调节物质、抗氧化酶系统、丙二醛(MDA)等生理生化特征变化均反映出其具有一定的耐镉性。因此,运用香樟来修复Cd2+污染的土壤有较强的应用潜力[14]。

生长素是第一个被发现的植物生长激素[15]。吲哚乙酸(IAA)属于生长素中的一类,能够促进植物细胞伸长、分裂、分化,提高植物抗逆性,促进植物根系发育,增加叶片生物量,对植物的生长发育和生理生化有着重要影响[16]。有研究显示,生长素等植物激素可以利用特殊的生理性能刺激植物对环境养分的吸收,激发植物在逆境环境中的耐性潜力[17]。生长素能通过细胞膜质子泵三磷酸腺苷(ATP)酶激活质外体酸化,进而刺激相关蛋白酶修饰细胞壁,提升细胞壁的延展能力,促进植物细胞伸长,增大根系表面积[18]。李文静等[19]研究发现,喷施吲哚乙酸后,铝胁迫下栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim.)的光合参数得以改善,叶绿素质量分数升高,植物抗氧化酶活性增强,丙二醛积累量减少,Al毒害程度得以减轻。也有研究表明,施用生长素后土壤酶活性恢复稳定,能够缓解逆境对土壤微环境的破坏[20],这一现象说明,生长素的施加能够增强植物在逆境中的抗氧化酶活性及细胞膜结构稳定性,从而稳定土壤微生态环境,提高重金属污染土壤的修复效率。现有研究认为,生长调节剂的主要作用机制是当其作用于植物细胞后,会激发细胞膜上激素分子受体的感知,进而激活下游信号传导途径,并通过上调相关传导基因,促进植物产生螯合肽以螯合或缓解镉毒性[21]。有研究发现,喷施不同质量分数的吲哚乙酸对Al胁迫下紫花苜蓿(Medicagosativa)幼苗的生长具有不同程度的促进效果[22]。Pan et al.[23]指出,Cd胁迫下施加吲哚乙酸可激活谷胱甘肽-S-转移酶活性,使植物更好地应对应激反应。低质量分数的吲哚乙酸可以促进植物生长,而高质量分数的吲哚乙酸则会抑制植物生长,甚至导致死亡。目前,关于吲哚乙酸联合植物进行重金属污染修复方面的研究较少,尤其是外源添加吲哚乙酸对香樟修复Cd污染土壤的应用研究涉及不多。本研究通过盆栽试验,对香樟施加不同质量分数吲哚乙酸,探讨Cd胁迫下1年生香樟幼苗生理特性变化,为香樟和添加外源激素对重金属污染土壤的联合修复提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物为从浙江省嘉兴市海宁市盐官镇香樟苗圃园购买的长势均匀、高度为1 m的同批1年生香樟实生苗。栽种前将香樟侧枝、叶片及根系进行修剪,保留3条侧枝,由幼苗茎基部向上截取高约50 cm的主干茎。于2021年4月种植幼苗。

供试土壤采集于安徽省马鞍山市和县农田,剔除石块、大中型土壤动物及根茬等残体后,风干过2 mm筛待用。土壤pH为5.21,全氮质量分数为0.81 g·kg-1,全磷质量分数为0.48 g·kg-1,全钾质量分数为1.63 g·kg-1,未检出Cd。在幼苗度过50 d缓苗生长期后,对盆栽土壤进行污染处理。精确配制质量浓度为2 g·L-1的CdCl2·2.5H2O(分析纯)溶液作为母液(溶液质量浓度以Cd2+量计算),按照试验设计,均匀浇灌于香樟盆栽土壤中,使土壤Cd污染质量分数为20 mg·kg-1(以Cd2+量计算),达到土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准筛选限值(GB3660-2018)。

水溶性肥料购于中国史丹利农业集团股份有限公司,主要成分为w(N+P2O5+K2O)>60%,w(N)∶w(P)∶w(K)=1∶1∶1,w(Zn+Fe+Mn+B)为0.2%～3.0%。

生长调节剂(IAA)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。在光照条件较差的傍晚,准确称量吲哚乙酸并用超纯水配置出相应质量分数的吲哚乙酸溶液并将其施加到Cd污染土壤中。

1.2 试验设计

本试验用18 cm(径)×19 cm(高)花盆装土2 kg(干质量)栽种幼苗。于2021年6月1日—2021年7月15日进行为期45 d的培养试验,测定香樟生长、生理生化相关指标。试验共设有5个处理,分别为:CK(未污染土壤)、C0(添加Cd 20 mg·kg-1+未添加吲哚乙酸)、C1(添加Cd 20 mg·kg-1+添加吲哚乙酸5 mg·kg-1)、C2(添加Cd 20 mg·kg-1+添加吲哚乙酸10 mg·kg-1)、C3(添加Cd 20 mg·kg-1+添加吲哚乙酸40 mg·kg-1)。

每个处理分别设置5个重复,按农田常规施肥量(添加N 300 kg·hm-2,添加P 150 kg·hm-2)计算,将水溶性肥料稀释后作基肥施用。香樟生长期间通过称量浇水的方式浇灌去离子水,保持土壤持水量约为最大含水量的60%,夜晚一次性在土壤中施加吲哚乙酸溶液。

1.3 指标测定方法

丙二醛质量摩尔浓度采用硫代巴比妥酸显色法测定[24];叶绿素质量分数采用95%乙醇浸提法测定;超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑比色法测定[25];过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚比色法进行测定[26];可溶性蛋白质量分数采用考马斯亮蓝G-250比色法测定;可溶性糖质量分数采用蒽酮比色法测定[27];抗坏血酸(ASA)采用分光光度计法测定[28];谷胱甘肽(GSH)使用DTNB比色法测定[29]。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2010对试验数据进行整理;IBM SPSS Statistics 26.0软件进行相关分析和单因素方差分析;采用邓肯多重比较分析不同处理间的差异,差异显著水平为5%。

2 结果与分析

2.1 不同质量分数吲哚乙酸对Cd胁迫下香樟叶片可溶性蛋白和可溶性糖质量分数的影响

由表1可知,单Cd污染土壤处理(C0)的香樟叶片可溶性蛋白质量分数比CK显著增加了117.99%;C1、C2处理的叶片可溶性蛋白质量分数与C0相比分别显著下降了34.39%、57.70%;C3与C0处理间可溶性蛋白质量分数无显著性差异;C1、C2处理与CK间无显著性差异。C0处理与CK相比,可溶性糖质量分数显著增加了17.44%;而C1、C2、C3处理与C0相比,可溶性糖质量分数显著下降,分别下降了10.30%、34.89%、29.72%;C1处理与CK相比,可溶性糖质量分数无显著性差异;C2、C3处理与CK相比分别显著降低了23.54%、17.45%。

表1 不同处理时香樟叶片中可溶性蛋白质量分数和可溶性糖质量分数

2.2 外源施加吲哚乙酸对Cd胁迫下香樟叶片光合作用的影响

由表2可知,在单Cd污染的条件下(C0)香樟叶片的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素质量分数与CK相比,分别显著降低了27.71%、27.15%、27.57%。C1、C0处理的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素质量分数无显著性差异。C2处理与C0处理相比,叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素质量分数,分别显著增加了60.67%、60.13%、32.85%;C3处理与C0处理相比,叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素质量分数,分别显著增加了58.58%、30.93%、31.33%。C3处理与CK相比,叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素质量分数无显著性差异。C1、C2、C3处理,与CK间的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素质量分数、w(叶绿素a)∶w(叶绿素b)无显著性差异。

另外,w(可溶性糖)∶w(可溶性蛋白)变化趋势,与叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素变化趋势一致,呈现先下降后上升再下降的趋势。其中,在Cd污染条件下,C2处理的比值最高,且在该处理时叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素质量分数最高。

2.3 施用不同质量分数吲哚乙酸对Cd胁迫下香樟叶片丙二醛质量摩尔浓度的影响

由表3可以看出,单Cd污染土壤(C0)香樟叶片的丙二醛质量摩尔浓度与CK相比显著增加了31.04%。处理C2、C3与C0处理相比,丙二醛质量摩尔浓度分别显著降低了22.22%、25.91%,与CK相比则无显著性差异。随着施加吲哚乙酸质量分数的升高,丙二醛质量摩尔浓度逐渐降低,但无显著性差异。C1、C2、C3处理与CK相比,丙二醛质量摩尔浓度无显著性差异。

表2 不同处理时香樟叶片色素质量分数及w(可溶性糖)∶w(可溶性蛋白)

表3 不同处理时香樟叶片丙二醛质量摩尔浓度

2.4 施用不同质量分数吲哚乙酸对Cd胁迫下香樟叶片超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性的影响

由表4可知,单Cd污染土壤处理(C0)时,香樟叶片的超氧化物歧化酶活性与CK相比显著增加了19.54%;添加吲哚乙酸的3个处理与C0相比,超氧化物歧化酶活性略有降低但无显著性差异。C0处理的香樟叶片过氧化物酶活性与CK相比,显著增加了107.49%;C1与C0处理相比,过氧化物酶活性略有升高的趋势,但二者间无显著性差异;C2、C3与C1处理相比,过氧化物酶活性分别显著降低了37.79%、53.70%,且与CK无显著差异。

表4 不同处理时香樟叶片超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性

2.5 施用不同质量分数吲哚乙酸对Cd胁迫下香樟叶片抗坏血酸和谷胱甘肽质量摩尔浓度的影响

由表5可知,C0处理与CK相比,抗坏血酸质量摩尔浓度显著增加了50.24%;C1、C2与C0处理相比,抗坏血酸质量摩尔浓度分别显著降低了63.49%、28.55%,C3与C0处理相比则无显著性差异。C1、C2、C3处理的抗坏血酸质量摩尔浓度存在显著性差异,随着施加的吲哚乙酸质量分数增加,抗坏血酸质量摩尔浓度显著升高。C0处理与CK相比,谷胱甘肽质量摩尔浓度显著增加了50.24%;C1、C2、C3与C0处理相比,谷胱甘肽质量摩尔浓度分别显著下降了56.42%、66.03%、63.14%,C1、C2、C3处理间无显著性差异。

表5 不同处理时香樟叶片抗坏血酸和谷胱甘肽质量摩尔浓度变化

2.6 香樟生理生化指标相关性

香樟叶片的过氧化物酶活性,与超氧化物歧化酶活性、可溶性糖质量分数呈显著正相关(P<0.05),与可溶性糖质量分数呈极显著正相关(P<0.01)。超氧化物歧化酶活性,与可溶性蛋白质量分数呈显著正相关(P<0.05),与w(可溶性糖)∶w(可溶性蛋白)呈极显著负相关(P<0.01)。丙二醛质量摩尔浓度,与可溶性糖质量分数、谷胱甘肽质量摩尔浓度呈极显著正相关(P<0.01),与总叶绿素质量分数呈极显著负相关(P<0.01)。可溶性糖质量分数,与谷胱甘肽质量摩尔浓度呈极显著正相关(P<0.01),与总叶绿素质量分数呈极显著负相关(P<0.01)。可溶性蛋白质量分数,与w(可溶性糖)∶w(可溶性蛋白)呈极显著负相关(P<0.01),与抗坏血酸质量摩尔浓度呈极显著正相关(P<0.01),与总叶绿素质量分数呈显著负相关(P<0.05)。w(可溶性糖)∶w(可溶性蛋白)与抗坏血酸质量摩尔浓度呈极显著负相关(P<0.01)。谷胱甘肽质量摩尔浓度与总叶绿素质量分数呈极显著负相关(P<0.01)。

表6 香樟叶片生理生化指标的相关性

3 讨论

植物叶片中叶绿素质量分数在一定程度能够反映植物进行光合作用的强度,与植物的生长发育有着密切的关系[30]。本研究发现,受到Cd污染后,1年生香樟叶片的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素质量分数均显著下降,这是因为重金属被植物吸收后,会抑制叶绿素合成酶的活性,同时促进叶绿素分解酶活性的提高,从而导致叶绿素质量分数下降[31]。3种不同质量分数的生长素均使香樟叶片的叶绿素质量分数显著增加,其中C2处理时增加最为显著,原因是施加外源生长素有利于促进植物光合色素的合成[32],较高质量分数的生长素与Cd产生协同,对植物叶绿素的合成产生了抑制[33]。通过观察ω(可溶性糖)∶ω(可溶性蛋白)变化情况可以发现,C2处理的香樟生长状况最好,原因是加入10 mg·kg-1生长素后促进了香樟叶片细胞的分裂分化,其叶片所需蛋白质质量分数增加,同时,该处理增强了叶片的光合作用,提高了糖类积累量[34]。C3处理的ω(可溶性糖)∶ω(可溶性蛋白)与C2相比有所下降,说明添加高质量分数的生长素对Cd胁迫的缓解作用不明显。

丙二醛是植物细胞膜脂过氧化的产物,其质量摩尔浓度的高低反映了植物细胞受氧化损害程度的大小[35]。本研究中,在添加了Cd污染后,香樟叶片的丙二醛质量摩尔浓度显著上升,说明Cd胁迫使香樟受到了明显的氧化损伤;施加了低质量分数的生长素后略微缓解了重金属Cd对香樟的毒害作用,但作用并不明显;添加了较高及高质量分数的生长素后明显缓解了重金属Cd对香樟的毒害作用,且添加的吲哚乙酸质量分数越高,对重金属Cd毒害的缓解效果越明显。

超氧化物歧化酶是植物体内酶促防御体系中的膜保护酶之一[36],其可以将植物体中的氧自由基转化为H2O2和O2,从而减轻环境胁迫对植物细胞组织的毒害[37]。在Cd污染的胁迫下,香樟叶片的超氧化物歧化酶活性显著上升,说明Cd胁迫促进了香樟的酶促防御体系的启动,使其更好地适应胁迫环境。但是,施加不同质量分数的生长素后未对香樟叶片超氧化物歧化酶活性产生影响,而是使其活性维持在了一定水平,这是因为香樟的抗胁迫能力较强,已经适应胁迫环境,或者是香樟通过其他途径缓解了重金属Cd对自身的毒害作用。过氧化物歧化酶是植物体内的一种氧化还原酶,其作用是催化有毒物质氧化分解。过氧化物歧化酶活性在植物受到Cd胁迫时会升高,这是因为Cd进入植物后产生了对自身有害的过氧化物,而过氧化物歧化酶则可以利用H2O2来催化过氧化物的氧化分解。因此,随着植物体内过氧化物质量分数的增加,过氧化物歧化酶活性也随之增加[38]。在本研究中,Cd胁迫时香樟叶片的过氧化物歧化酶活性显著增加,而随着添加的生长素质量分数增加,香樟叶片的过氧化物歧化酶活性显著下降,说明外源施加生长素在香樟的抗氧化过程中起到了重要的作用。

可溶性糖在植物体内具有渗透保护、碳储存、清除自由基的作用。可溶性蛋白作为细胞的重要组成部分,可以对外界胁迫产生响应,且可溶性蛋白与植物细胞的渗透调节机制有关[39]。本研究中,Cd胁迫时香樟叶片的可溶性糖和可溶性蛋白质量分数显著增加,说明在Cd胁迫下,香樟可通过可溶性糖和可溶性蛋白等渗透调节物质来降低细胞渗透势以缓解Cd对植物造成的伤害[40]。在施加了不同质量分数的生长素后,香樟叶片的可溶性蛋白和可溶性糖质量分数呈现先下降后上升的趋势。C2处理的香樟叶片可溶性蛋白和可溶性糖质量分数最低,对重金属毒害缓解效果最为明显;C3处理的香樟叶片可溶性蛋白质量分数显著上升,可溶性糖质量分数略有上升。综上,与Cd污染处理相比,施加不同质量分数的生长素对Cd胁迫有不同程度的缓解。在添加低质量分数和较高质量分数的生长素后,可有效缓解重金属Cd对香樟的胁迫,而添加高质量分数的生长素对Cd胁迫的缓解作用不明显。

在植物的抗坏血酸-谷胱甘肽循环中,抗坏血酸是重要的抗氧化物质,其能与谷胱甘肽进行偶联以增强植物对活性氧的清除能力。本研究中,香樟在Cd污染条件下抗坏血酸质量摩尔浓度显著上升,而添加了低质量分数和较高质量分数的生长素后,香樟的抗坏血酸质量摩尔浓度出现不同程度的下降,说明了添加低质量分数和较高质量分数的生长素可以有效缓解香樟的重金属胁迫。而添加了高质量分数的生长素对香樟所受胁迫的缓解不显著,出现该现象的原因是高质量分数的生长素对香樟产生了胁迫,再次破坏了香樟中活性氧自由基产生与清除之间的平衡关系[41]。谷胱甘肽也是抗坏血酸-谷胱甘肽循环中的一种重要的抗氧化剂,主要功能是参与H2O2的清除。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的巯基三肽[42-43],是植物螯合肽合成的底物,在植物Cd解毒中起着重要作用。有研究表明,往往在谷胱甘肽减少的同时伴随着植物螯合肽的生成[44]。植物螯合肽的主要功能是络合金属元素[45],植物可以通过络合作用来消除过量重金属离子对本体的伤害。不同分子质量的多肽对重金属的络合能力有所不同,单肽不具有络合重金属的能力或作用很小[46]。有研究认为Cd2+在植物体内能够直接与产生的植物螯合肽相结合[47]。本研究中,添加了Cd污染后,香樟的谷胱甘肽质量摩尔浓度显著上升,说明香樟一方面可以通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统清除活性氧物质,另一方面通过螯合Cd2+,将其运输隔离至细胞液泡中,形成耐Cd、避Cd的双途径。在施加了3种不同质量分数的生长素溶液后,香樟叶片的谷胱甘肽质量摩尔浓度均显著下降,这是因为进入细胞的Cd激活了植物螯合肽合成酶[48],进而促进了植物螯合肽的合成,导致谷胱甘肽质量摩尔浓度减少[49]。谷胱甘肽质量摩尔浓度的降低有助于减少膜脂氧化产物如丙二醛等的积累,进而提高植物抗氧化胁迫能力以抵御镉毒害[50]。也有研究表明,添加外源物能够定向调控植物谷胱甘肽的分配与利用,使其更好、更高效地促进植物生长[51]。因此,在施加生长素后改变了谷胱甘肽的作用途径,使得香樟叶片谷胱甘肽质量摩尔浓度下降。

4 结论

Cd胁迫明显抑制了香樟的生长和光合作用。随着添加外源生长素质量分数的增加,香樟的可溶性蛋白质量分数、可溶性糖质量分数、超氧化物歧化酶活性、叶绿素质量分数、抗坏血酸质量摩尔浓度、谷胱甘肽质量摩尔浓度呈现先降低后升高趋势。施加了10 mg·kg-1的吲哚乙酸对Cd胁迫的缓解效果最为明显,该处理显著提高了香樟叶片的叶绿素质量分数,有利于促进香樟的光合作用,显著降低香樟叶片的可溶性蛋白质量分数、可溶性糖质量分数、谷胱甘肽质量摩尔浓度。而施加质量分数较高的吲哚乙酸溶液(40 mg·kg-1)对香樟Cd胁迫的缓解效果不明显。