动物模型研究炎症小体在海水淹溺诱发过敏性鼻炎中的作用

周烨，郏凯威，李云晖，侯晋，杨子轩

海水淹溺是航海作业中的常见事故，特别是在海上作战或海上救援时，在落水人员中多有发生。海水含大量氯化钠和钙镁盐类的高渗液体，对鼻黏膜、呼吸道和肺泡有强烈的化学刺激作用，可引起机体产生多种细胞因子和趋化因子介导的炎症反应，因此海水淹溺严重者可形成海水淹溺型肺损伤（seawater drowning induced acute lung injury，SWALI）或海水淹溺型急性呼吸窘迫综合征（seawater drowning induced acute respiratory distress syndrome，SW-ARDS）［1-2］。与此同时，在航海过程中，环境变化、气候影响、工作强度均在一定程度上会对海军官兵的免疫力造成影响，增加海水侵入鼻黏膜后引起过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的患病风险，不仅影响官兵的正常工作和生活，还可诱发并发症，如过敏性哮喘、鼻窦炎，影响官兵的身心健康，严重时会影响官兵正常训练［3］。既往研究发现，在体外采用高渗盐溶液处理原代鼻腔上皮细胞可引起鼻黏膜纤毛和屏障受损［4］，提示海水淹溺很可能造成患者鼻黏膜损伤，引起炎症。本课题组前期研究发现，炎症小体在小鼠AR 的发病过程中发挥重要作用［5］，然而海水淹溺诱发AR 发病的过程尚未阐明，炎症小体是否在其中发挥重要作用亦未知。笔者通过构建小鼠海水淹溺诱发过敏性鼻炎（seawater drowning induced allergic rhinitis，SW-AR）模型，研究AR 症状伴随的炎症小体活化变化趋势，通过使用抑制剂，观察SW-AR 的发病情况，以期为临床治疗提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 实验小鼠 雄性Balb/c 小鼠15 只，8 周龄，体重20～25 g，购买于上海必凯实验动物公司，在SPF 级环境下饲养于海军军医大学实验动物中心，适应性饲养1 周。15 只Balb/c 小鼠按数字表法随机分为3 组，每组5 只。

1.2 主要试剂 PrimeScript 反转录试剂盒、SYBR Premix ExTaq 实时荧光定量PCR 试剂盒、组织总RNA 抽提试剂Trizol 均购自TAKARA 公司。海水采样自东海海域，其中主要电解质含量：Na+460 mmol/L，K+8.5 mmol/L，Cl-518 mmol/L，Mg2+6.2 mmol/L，Ca2+5.1 mmol/L，pH 值8.2。卵清蛋白（OVA）腹腔注射致敏工作液（1 mg/ml）：无菌条件下称取1 mg OVA 粉剂，溶于1 ml 生理盐水，按1∶1 的比例与Imject®Alum 混合，充分混匀，4 ℃保存。炎症小体活化抑制剂Belnacasan（VX-765）购自Selleck（S2228），Belnacasan 溶 解 于 含2% DMSO 和30% PEG 300 的双蒸水中，终浓度5 mg/ml［5-6］。

1.3 不同组小鼠处理方法 小鼠预先致敏，第0、7、14 天进行3 次腹腔注射OVA 工作致敏液，注射剂量每次100 μl/只。空白对照组不处理；SW-AR组小鼠鼻腔内滴入40 μl 海水/只，10 min 后给予小鼠滴鼻OVA（50 mg/ml，20 μl/只），每天1 次，连续进行3 d；抑制剂组小鼠鼻腔内滴入40 μl 海水/只，10 min 后给予小鼠滴鼻OVA（50 mg/ml，20 μl/只），10 min 后滴鼻炎症小体活化抑制剂Belnacasan（5 mg/ml，20 μl/只），1 次/d，连续进行3 d。

1.4 观察指标 （1）分别于建模1 h 后，观察记录挠鼻/喷嚏症状。其中挠鼻定义为小鼠前爪抓挠鼻部或四处摩擦，将小鼠放置于一空框，分别记录10 min 内小鼠挠鼻和喷嚏的次数。（2）取鼻黏膜组织，使用Trizol 试剂提取总RNA［7］。实时荧光定量PCR 检测鼻黏膜组织中白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、IL-18 mRNA 水平的表达，以β-actin 作为内参。IL-6 检测引物forward：5＇-TAG TCC TTC CTA CCC CAA TTT CC -3＇，reverse：5＇- TTG GTC CTT AGC CAC TCC TTC-3＇；IL-1β 检 测 引 物forward：5＇-GGT GTG TGA CGT TCC CAT TAG AC-3＇，reverse：5＇-CAT GGA GAA TAT CAC TTG TTG GTT GA-3＇；IL-18 检测引物forward：5＇-GAC TCT TGC GTC AAC TTC AAG G-3＇，reverse：5＇-CAG GCT GTC TTT TGT CAA CGA-3＇；β-actin 检测引物forward：5＇-AGT GTG ACG TTG ACA TCC GT-3＇，reverse：5＇-GCA GCT CAG TAA CAG TCC GC-3＇。（3）眼球取血，酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测小鼠血清中IL-18 蛋白水平，按照说明书进行操作。（4）取鼻黏膜组织，使用苏木精-伊红（Hematein Eosin，HE）染色小鼠鼻黏膜组织切片，观察病理切片结果。（5）取鼻黏膜组织5 mg，提取总蛋白，Western blotting 检测炎症小体活化程度，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）-1 p20 和gasdermin-D（GSDMD）活化情况。

1.5 统计学处理 采用Graphpad Prism 8 进行数据统计分析。Western blotting 结果量化使用Image J 软件完成，以β-actin 为内参。计量资料采用表示，组间采用非配对t检验分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠AR 行为学特征及鼻黏膜组织HE 染色比较 结果显示，SW-AR 组小鼠挠鼻和喷嚏次数明显多于对照组（P＜0.01），见表1。同时SW-AR组鼻黏膜组织出现明显损伤，上皮细胞排列紊乱，纤毛上皮存在部分脱落现象。AR 行为学特征和组织切片染色结果证实模型构建成功，见图1。与SW-AR 组比较，抑制剂组小鼠AR 行为学症状明显缓解（P＜0.01），鼻黏膜组织上皮细胞排列基本规则，纤毛上皮基本未出现脱落现象，这说明炎症小体活化抑制剂可有效缓解海水吸入破坏鼻黏膜组织，缓解其造成的AR 更易诱发现象。

表1 对照组、SW-AR 组、抑制剂组小鼠AR 行为学特征（）

表1 对照组、SW-AR 组、抑制剂组小鼠AR 行为学特征（）

注：与对照组比较aP＜0.01；与SW-AR 组比较bP＜0.01。SW-AR为海水淹溺诱发过敏性鼻炎，AR 为过敏性鼻炎

喷嚏（次/10 min）2.60 ± 1.14 16.20 ± 3.03a 7.20 ± 1.92ab组别对照组SW-AR 组抑制剂组例数55 5挠鼻（次/10 min）5.00 ± 1.58 21.20 ± 3.83a 8.80 ± 1.92ab

2.2 小鼠鼻黏膜内细胞因子表达情况 结果显示，与对照组比较，SW-AR 组小鼠鼻黏膜内常见细胞因子表达显著升高（P＜0.01），提示其处于高敏的炎症状态。与SW-AR 组相比，抑制剂组小鼠鼻黏膜组织内细胞因子IL-6、IL-1β、IL-18 的表达显著降低（P＜0.01）。这提示炎症小体活化抑制剂可有效减轻鼻黏膜组织局部炎症反应。见表2。

表2 对照组、SW-AR 组、抑制剂组小鼠鼻黏膜内细胞因子IL-6、IL-1β、IL-18 mRNA 相对表达量（）

表2 对照组、SW-AR 组、抑制剂组小鼠鼻黏膜内细胞因子IL-6、IL-1β、IL-18 mRNA 相对表达量（）

注：与对照组比较aP＜0.01；与SW-AR 组比较bP＜0.01。SWAR 为海水淹溺诱发过敏性鼻炎，IL 为白细胞介素

IL-18组别例数IL-6IL-1β 1.004 ± 0.085 4.400 ± 0.224a 1.520 ± 0.246ab对照组SW-AR 组抑制剂组555 1.042 ± 0.201 6.002 ± 0.368a 2.848 ± 0.208ab 1.006 ± 0.148 7.596 ± 0.451a 2.164 ± 0.329ab

2.3 小鼠血清内IL-18 的蛋白水平比较 结果显示，与对照组相比，SW-AR 组小鼠血清中IL-18 蛋白水平显著升高（P＜0.01），既往研究提示AR 小鼠鼻黏膜内炎症小体高度活化，可导致IL-18 分泌增多［5］，提示SW-AR 小鼠可能存在炎症小体活化。与SW-AR 组相比，抑制剂组小鼠血清内IL-18 蛋白水平降低，差异有统计学意义（P＜0.01），这一结果提示鼻黏膜局部使用炎症小体活化抑制剂可有效抑制炎症小体活化。见表3。

表3 对照组、SW-AR 组、抑制剂组小鼠血清内IL-18 蛋白表达水平（）

表3 对照组、SW-AR 组、抑制剂组小鼠血清内IL-18 蛋白表达水平（）

注：与对照组比较aP＜0.01；与SW-AR 组比较bP＜0.05。SWAR 为海水淹溺诱发过敏性鼻炎，IL 为白细胞介素

IL-18 表达水平63.200 ± 5.762 446.600 ± 48.998a 137.000 ± 49.522ab组别对照组SW-AR 组抑制剂组例数555

2.4 小鼠鼻黏膜局部炎症小体活化情况 结果显示，与对照组比较，SW-AR 组小鼠鼻黏膜组织存在高度活化的炎症小体及细胞焦亡（P＜0.01），这很有可能是海水淹溺更易诱发AR 的潜在机制。与SWAR 组比较，抑制剂组小鼠炎症小体活化明显减少（P＜0.01）。这提示鼻黏膜局部使用炎症小体活化抑制剂可有效减轻海水吸入所导致的鼻腔局部炎症小体活化。见图2、表4。

图2 Western blotting 电泳图

表4 对照组、SW-AR 组、抑制剂组小鼠鼻黏膜组织内caspase-1 p20 和GSDMD 活化情况（）

表4 对照组、SW-AR 组、抑制剂组小鼠鼻黏膜组织内caspase-1 p20 和GSDMD 活化情况（）

注：与对照组比较aP＜0.05，bP＜0.01；与SW-AR 组比较cP＜0.01。SW-AR 为海水淹溺诱发过敏性鼻炎

GSDMD-N/β-actin组别例数caspase-1 p20/β-actin 0.341 ± 0.049 1.338 ± 0.152b 0.573 ± 0.142 bc对照组SW-AR 组抑制剂组555 0.202 ± 0.039 1.049 ± 0.115b 0.287 ± 0.062ac

3 讨论

既往研究多关注于海水淹溺诱导的急性肺损伤及其激发的急性呼吸窘迫综合征（ARDS），常常忽略了其后发生的慢性炎症反应疾病，如海水淹溺导致大量盐类高渗溶液侵入鼻黏膜组织，造成局部组织缺氧、出血和炎症损伤，进而使患者更易诱发AR 症状［3,8］。慢性炎症疾病在发病初期往往容易被忽视，导致错过最佳治疗时间，长期慢性炎症可发展为过敏性哮喘或鼻窦炎［4,8-10］，严重时会影响官兵的战斗力。笔者利用小鼠SW-AR 模型，通过观察小鼠行为学特征、鼻黏膜组织切片，明确海水淹溺可导致小鼠更易诱发典型的AR 症状。这一模型的成功构建为SW-AR 发病机制和相应治疗提供了重要支撑。

本研究探讨了SW-AR 小鼠的行为学表现和炎症反应水平，而对于其中浸润的免疫细胞的活化情况和亚群尚未进一步鉴定，例如通过流式检测组织和血清内Th2 细胞、天然免疫淋巴细胞（ILC2）、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和肥大细胞的数量和活化情况（重要细胞因子分泌水平）、鼻黏膜中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞发生胞外陷阱的情况［11-12］、肺神经分泌细胞（PNEC）分泌神经递质的改变等［13］。因此，通过对SW-AR 小鼠鼻黏膜中免疫细胞的测定，可进一步解析明确其鼻黏膜局部炎症反应发生的潜在机制。

NOD 样受体家族介导的炎症小体活化及其放大环路是天然免疫应答的重要环节，参与了多种外源性微生物感染、神经退行性疾病、糖尿病、肿瘤等疾病的进展过程［14］。本课题组前期研究发现NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体活化及其诱导的鼻黏膜细胞过度焦亡在OVA 诱导的AR 的发生发展过程中发挥重要作用［5］。本研究进一步拓展分析了炎症小体活化参与AR 的功能，证实其亦可能参与SW-AR 的发病过程。目前已知的人NOD 样受体家族受体包含22 个分子，根据其N 端不同效应结构域可分为4 个亚家族［15］，除了NLRP3外，其他NOD 样家族分子是否可能参与SW-AR 疾病的发展过程，识别DNA 活化的AIM2 炎症小体是否也在SW-AR 中发挥调控作用，都是值得进一步研究和阐明的方向。

基于上述炎症小体活化及其放大炎症环路参与SW-AR 的疾病进展过程，笔者使用炎症小体活化的特异性抑制剂治疗SW-AR 小鼠。本研究发现，在海水淹溺后给予炎症小体抑制剂治疗，可有效缓解SW-AR 症状，这一结果提示炎症小体很可能成为SW-AR 临床治疗的新靶点，也为免疫调节治疗SW-AR 的研究提出了新的方向。