基于网络药理学探讨健胃消胀片治疗胃肠动力障碍性疾病的作用机制

莫绮君，卢汉祺，陈翻享，方笑媚

在重症监护室（ICU），重症患者的营养支持与预后紧密相关，合理的营养支持可以促进患者恢复，提高免疫力，尽早脱离呼吸机，缩短患者在ICU的住院时间，减少并发症发生率及死亡率［1］。但ICU 患者，尤其老年患者常存在多种基础病，合并多器官衰竭，当面对感染、创伤、手术等应激状态，常会出现免疫失调、持续炎症、代谢分解异常等情况［2］。患者在重症下常合并胃肠动力障碍，故尽早恢复肠道正常动力功能对促进ICU 患者的康复和预后至关重要。

胃肠动力障碍性疾病（DGIM）是指由胃肠动力紊乱引起的以恶心、呕吐、胃潴留、胃瘫、排便异常等各种消化道症状为临床表现的疾病［3］。胃肠动力紊乱是其主要的病理生理机制，具体发病机制尚在研究中，包括胃肠Cajal 间质细胞（ICC）、胃肠激素和5-羟色胺（5-HT）、肠壁微血管病变和微循环障碍、代谢紊乱等肠壁神经、调节因子或细胞研究及中枢神经系统“脑-肠轴”的调节作用［3-4］。胃肠动力障碍归属中医“痞满”等范畴，在《内经》《伤寒论》《诸病源候论》等诸多经典中均有诉述。中医在中药、针灸等方面对胃肠动力障碍治疗有丰富经验和良好疗效。

健胃消胀片为东莞中医院院内制剂，是根据通降胃气之法创立，有行气消痞、调和气血的功用。其以枳壳、大腹皮、沉香为君药行气消胀，鸡内金、山药健脾胃以降胃气，莪术活血祛瘀，行补药之滞，紫苏梗顺气和胃，兼升清脾气，旱莲草、石斛清胃热而养胃阴，调和前药之温性，甘草调和诸药［5］。临床已证实其对慢性胃炎、功能性消化不良、溃疡病等有较好的治疗效果。由于中药复方治疗疾病是通过其中的有效成分综合作用的，运用网络药理学整合系统生物学、网络分析及多向药理学等多学科技术，可从新的角度研究中药复方的药效物质基础及药理作用机制。

1 材料与方法

1.1 获取中药活性成分及靶点 健胃消胀片（粤药制字：Z20110147）主要由枳壳、大腹皮、鸡内金、山药、莪术、紫苏、旱莲草、石斛、甘草组成，利用中药系统药理分析平台（https：//tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）［6］，以主要成分名称为关键词检索，根据生物口服利用度（OB）≥30% 和类药性（DL）≥0.18［7］筛选候选化合物，候选化合物通过TCMSP 和Drugbank 数据库收集相应的靶点信息。靶点命名通过Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）进行标准化。

1.2 获取胃肠动力障碍疾病靶点 在Genecards（https：//www.genecards.org/）数据库和在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库（https：//www.omim.org/）以疾病关键词“DGIM”进行检索，得到DGIM 的疾病靶点。

1.3 获取中药-疾病共同靶标并绘制维恩图 将健胃消胀片中9 味中药的作用靶点与DGIM 的疾病靶点导入维恩图（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）取交集，筛选出DGIM 与健胃消胀片的交集靶点，并绘制维恩图。

1.4 构建“化合物-交集靶点”网络图 获取交集靶点后，对化合物进行反向筛选，剔除不含交集靶点的药物成分，根据上述得到的健胃消胀片活性成分及其对应靶点，在Excel 表格中建立相互对应的关系，导入Cytoscape 3.7.2 软件中，构建健胃消胀片治疗DGIM 的“成分-交集靶点”网络药理图［8］。

1.5 蛋白质相互作用网络图 将获得的交集基因上传到STRING（https：//string-db.org/）数据分析平台进行蛋白质相互作用分析。数据分析模式设定为“Multiple proteins”，物种设定为“Homo sapiens”，导出图像及数据。运用Cytoscape3.7.2 软件绘制蛋白质相互作用网络（PPI）图，依据度值对蛋白质进行排列。

1.6 GO 和KEGG 富集分析 将得到的药物与疾病交集靶点上传至DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）平台，设置物种为“Homo sapiens”，设置筛选条件为“official gene symbol”。对健胃消胀片的作用靶点进行基因本体（GO）功能富集分析以及京都基因和基因组百科全书（KEGG）代谢通路富集分析。以P＜0.05 为筛选条件得出排名靠前的生物过程和通路，并对数据结果进行可视化。

1.7 分子对接 挑选“化合物-交集靶点”网络图中节点排名在前5 的化合物，将其分别与蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）图中度值排名前6 的核心蛋白质分子进行分子对接。首先利用Pubchem（https //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）及PDB 数据库（https：//www1.rcsb.org/）分别下载3 种化合物sdf 格式的3D 结构文件和蛋白质大分子的pdb 格式文件；使用OpenBable 2.3.1 软件把活性化合物的3D 结构文件由sdf 格式转化为mol2 格式；利用Pymol 软件去除蛋白质大分子的水分子和配体，并把蛋白质大分子的3D 结构保存为pdb 文件；最后用Autodock-Tools 软件对蛋白质分子与活性成分分子进行分子对接；利用Pymol 2.3.1 软件进行对接结果的优化及可视化。

2 结果

2.1 健胃消胀片的活性成分及靶点 通过TCMSP数据库，设定OB≥30%，DL≥0.18 为筛选条件，最终得到健胃消胀片候选化学物136 个。见表1。根据136 个健胃消胀片候选化学物，通过TCMSP 数据库和Drugbank 数据库分别获取2 356 和39 个靶点信息，共得到2 395 个靶点。

表1 健胃消胀片136 个候选化学物基本信息

续表

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2.2 中药-疾病共同靶标 通过Genecards 和OMIM 数据库分别得到“DGIM”的疾病靶点有998 个和35 个，共1 033 个疾病靶点。维恩图分析显示健胃消胀片成分靶点与DGIM 的疾病靶点共有192 个交集靶点。见图1。

图1 健胃消胀片与DGIM 交集靶点

2.3 “化合物-交集靶点”网络图 利用交集靶点反向筛选出136 个化合物，筛选出化合物后利用Cytoscape 3.7.2 软件构建“化合物-交集靶点”网络图。图中共有326 个节点，1 648 条边，其中有143 个药物成分节点，183 个靶节点。见图2。根据节点连线数值筛选出排名前9 的主要成分为β-谷甾醇（MOL000358）、芒柄花黄素（MOL000392）、异鼠李素（MOL000354）、山柰酚（MOL000422）、木犀草素（MOL000006）、槲皮素（MOL000098）、7-乙酰氧基-2-甲基异黄酮（MOL004991）、柚皮素（MOL004328）、川陈皮素（MOL005828）。

图2 化合物-交集靶点网络图

2.4 PPI 网络图 PPI 网络图显示共有191 个节点，4 110 条边，平均节点数为21.518。图中节点代表靶蛋白，边则代表靶蛋白之间的相互作用关系。在191 个节点中，节点连线数值排名前10 的有羟色胺（HT）、胰岛素样生长因子（IGF）、白细胞介素（IL）、一氧化氮合成酶（NOS）、肿瘤坏死因子（TNF）、血管活性肠肽（VIP）、白蛋白（ALB）、蛋白激酶1（AKI-1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）。见图3。提示以上靶点在健胃消胀片治疗DGIM 中起到关键的作用。

图3 药物-疾病PPI 网络图

2.5 GO 功能分析结果 利用DAVID 数据库对健胃消胀片治疗DGIM 的靶点进行GO 功能富集分析。设定P＜0.05 和FDR＜0.05 为筛选条件，共得到2 623 条GO 条目，其中生物过程（BP）条目2 349条，细胞组成（CC）条目102 条，分子功能（MF）条目172 条。分别选取BP、CC、MF 分析排名前20 条目进行数据可视化，BP 过程主要包括信号转导、基因表达调节、药物反应等；CC 主要包括细胞膜、细胞表面、细胞外基质、细胞核等；MF 主要包括与蛋白结合、ATP 结合、酶结合、受体结合等。见图4～6。

图4 健胃消胀片治疗DGIM 的GO BP 分析

图5 健胃消胀片治疗DGIM 的GO CC 分析

图6 健胃消胀片治疗DGIM 的GO MF 分析

2.6 KEGG 通路富集分析 通过DAVID 在线数据库对健胃消胀片与DGIM 的交集靶点进行KEGG通路富集分析。共得到174 条相关通路，取排名前20 的通路。见图7。与胃肠动力障碍相关的信号通路主要有磷脂酰肌醇3 激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（P13K/Akt）信号通路、HIF-1 信号通路、TNF 信号通路、IL-17 信号通路等。

图7 健胃消胀片治疗DGIM 的KEGG 通路富集分析

2.7 分子对接结果 把化合物-交集靶点网络图中节点数排名前5 的化合物和PPI 网络图中度值前6的蛋白质分子通过AutodockTools 软件进行分子对接。对接越稳定的配体和受体结合能越低，由分子对接的结果可推测5 种化合物能与PPI 中的核心靶点蛋白结合成稳定的构象。见表2。图8 为健胃消胀片核心成分和关键靶点分子对接的构象。

图8 健胃消胀片核心成分和关键靶点分子对接结合图

3 讨论

本研究通过TCSMP 中药系统药理学分析平台及TCMID 中药综合数据库筛选出健胃消胀片136 个活性成分，构建了健胃消胀片与DGIM 的化合物-交集靶点网络图，通过筛选得到健胃消胀片的活性成分主要有β-谷甾醇、芒柄花黄素、异鼠李素、山柰酚、木犀草素等。β-谷甾醇是大腹皮、枳壳、紫苏的活性成分，芒柄花黄素、山柰酚、异鼠李素是甘草的活性成分，木犀草素是紫苏、旱莲草的活性成分。β-谷甾醇是动、植物细胞膜的主要组成成分，表现出抗炎、抗肿瘤、抗溃疡等广泛生物活性。β-谷甾醇可能通过降低胃溃疡大鼠胃组织ET-1 mRNA 表达水平，升高大鼠胃组织甲状腺转录因子（TTF）-1、TFF-2 mRNA 水平，发挥胃黏膜保护作用［9］。有小鼠实验研究表明，β-谷甾醇可能通过核因子κB（NFκB）通路抑制炎症因子的表达，缓解急性结肠炎［10］。芒柄花黄素能有效地降低小鼠体内丙二醛（MDA）活性，提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，减少氧自由基的生成［11］。异鼠李素是槲皮素的代谢产物，较后者更易代谢和吸收，可能是通过抑制表皮生长因子受体（EGFR）的磷酸化，通过丝裂原活化蛋白激酶激酶1/磷脂酰肌醇3-激酶（MEK1/PI3K）信号转导通路，诱导结肠癌细胞凋亡［12］。另外有研究发现，异鼠李素通过抗炎、抗氧化应激、抗凋亡以保护内皮细胞［13］。山柰酚亦有抗肿瘤、抗氧化和抗炎等作用［14］。木犀草素在新生老鼠坏死性小肠结肠炎模型中可以通过抑制下调NFκB 蛋白表达，减少促炎因子TNF-α 的释放，上调抑炎因子IL-10 的表达，避免肠管黏膜进一步损害［15］。

通过构建PPI 网络图，筛选得到健胃消胀片治疗DGIM 的主要靶点有HT、IGF、IL、NOS、TNF、VIP。90%以上5-HT 由肠道合成，可以调节肠道多种功能，是脑-肠轴的关键神经递质。有研究表明，慢性便秘患者肠道菌群可以通过增加实验组小鼠肠道组织5-羟色胺转运体（SERT）表达，降低5-HT水平，从而减慢小鼠肠道运动，影响排便［16］。IGF-1主要来源于肝脏合成和肠道，可以促进细胞增殖、分化，抑制细胞凋亡，能有效促进肠道上皮细胞的增殖［17］。TNF-α 为炎症启动因子，IL-6 为一种促炎细胞因子，生理状态下调节多重免疫，维持机体生理平衡。当抑炎因子与促炎因子的平衡遭到破坏，引发胃肠黏膜炎症发生，溃疡性结肠炎患者体内IL-6、TNF-α 升高，更易发生菌群失调［18］。在肠道NO、VIP 均作为抑制性神经递质。NOS 作用是催化左旋精氨酸产生NO，实验表明通过降低大鼠结肠的NOS 表达，减少NO 生成，解除平滑肌抑制，恢复肠道蠕动功能［19］。另外VIP 在胃肠道可通过作用于受体VPAC1 调节胃酸及胃肠激素的分泌、血管舒张、调节肠道炎症反应等［20］。如VIP 通过VPAC1/Akt 信号通路抑制溃疡性结肠炎的肠道炎症反应，抑制上皮细胞凋亡，促进增殖［21］。

KEGG 分析结果显示，主要涉及PI3K/Akt 信号通路、HIF-1 信号通路、TNF 信号通路、IL-17 信号通路、Th17 细胞分化等。信号通路在人体生理或病理进展过程中均十分重要，还可能是疾病治疗的靶点［22］。PI3K/Akt 信号通路通过活化NF-κB，促炎因子表达增加，增强TNF-α 释放，促进肠道炎症反应［23］。另外PI3K/Akt 信号通路可以诱导肠上皮细胞自噬，介导细胞凋亡或坏死［24］，通过抑制该通路可以减轻肠道炎症，保护肠上皮细胞，恢复肠道屏障。山柰酚可抑制人结直肠癌RKO 细胞增殖并诱导其凋亡，同时可能通过下调PI3K/Akt/mTOR 信号通路降低PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白表达，诱导RKO 细胞自噬［25］。木犀草素通过PI3K/Akt 通路抑制结直肠癌细胞系HCT116 细胞表达基质金属蛋白酶9（MMP9）并下调其酶活性［26］。HIF-1α 是调节体内氧稳定的关键转录因子。在生理状态下，肠道黏膜中HIF-1 的表达较少或者未表达。在病理状态下，如缺氧应激时血液重分配，肠道血液灌流量急剧下降，造成局部缺血缺氧，HIF-1 的表达增加，炎症介质如TNF-α、IL-6 增多，促进炎症反应［27］，影响肠道屏障的正常生理功能。在急性胃肠功能障碍的发展中TNF-α 具有重要作用。TNF-α 作为炎症介质，能损伤内皮细胞，引起微血管广泛受损的同时可导致血液流变学紊乱［28］。相关研究发现TNFα 信号通路在一定程度上参与了急性胰腺炎的胃肠动力障碍，TNF-α 升高会造成肠黏膜缺血再灌注的损伤，加重肠黏膜的氧化应激反应，促进细胞凋亡脱落，TNF 水平升高，升高幅度越大，胃肠动力障碍越严重［29］。

综上所述，本研究通过网络药理学对健胃消胀片治疗DGIM 的作用机制进行系统分析，发现健胃消胀片中的β-谷甾醇、芒柄花黄素、异鼠李素、山柰酚、木犀草素等成分直接作用在HT、IGF、IL、NOS、TNF、VIP 等相关靶点，通过PI3K/Akt、HIF-1、TNF等信号通路，发挥抗炎、调控细胞因子的作用，恢复肠道屏障，促进胃肠功能恢复，体现了多靶点协助的调节作用。