小尾寒羊GHR、GHRH、GHRHR基因多态性与肉质性状的关联分析

韩志松 白俊艳 曾凡林 李静云 何豫涵 陈梦柯 卢小宁

摘要：主要分析GHR、GHRH、GHRHR基因的多态性，以及其与小尾寒羊肉质性状的关联，以期为优质绵羊新品种培育提供一定的参考依据。采用PCR技术，检测小尾寒羊群体中GHR、GHRH和GHRHR基因的多态性，利用SPSS软件分析以上3种基因的不同基因型与肉质性状的关联性。结果表明，GHR与GHRHR共有3种基因型，分别为II、ID、DD，而GHRH基因仅检测到2种基因型，分别为II、DD。GHR基因中II基因型频率最高，为0.625，ID的基因型频率为0.313，DD的基因型频率最低，为0.063；多态信息含量（PIC）为0.283，处于中度多态性（0.25≤PIC＜0.50）；小尾寒羊GHR基因的DD基因型肉质的色泽显著低于ID、II基因型（P＜0.05）。GHRHR基因中II基因型频率最高，为0.687 5，DD基因型频率最低，为0.062 5，ID基因型频率为0.2500；多态信息含量为0.258，处于中度多态性（0.25≤PIC＜0.50）；GHRHR基因的DD基因型的剪切力显著高于ID、II基因型（P<0.05）。GHRH基因中DD基因型频率最低，为0.437 5，II基因型频率最高，为0.562 5；多态信息含量（PIC）为0.371，处于中度多态性（0.25≤PIC＜0.50）；GHRH不同基因型对于小尾寒羊的所有肉质性状影响不显著（P>0.05）。综上所述，GHR基因、GHRHR基因可以作为小尾寒羊提升肉质品质的候选基因之一。

关键词：小尾寒羊；GHR基因；GHRHR基因；肉质性状；关联分析

中图分类号：S826.2 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）08-0145-05

基金项目：国家自然科学基金（编号：31201777）；博士启动基金计划（编号：20111148）；横向课题（编号：横20220047）。

作者简介：韩志松（1977—），男，辽宁阜新人，硕士，助理研究员，研究方向为畜牧生态模式。E-mail：hanzhisongcy@163.com。

通信作者，白俊艳，博士，副教授，研究方向为动物分子育种。E-mail：junyanbai@163.com。

生长激素受体（growth hormone receptor，简称GHR）基因在1976年从兔的肝脏细胞的细胞膜上被发现［1］。GHR基因对于加利福利亚兔的生长性能有促进作用［2］，可以作为候选基因，用来改善该奶牛群体的相关性能［3］。GHR-F279Y位點苯丙氨酸的编码T被酪氨酸编码A取代，导致其脂肪、蛋白质和乳的产量有所降低［4］。GHR基因的g.914T>A的T等位基因与肌肉以及乳房的大小呈现出正相关性［5］。GHR基因还可以为安纳托利亚水牛早期选种提供一定的优势［6］。 生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone，简称GHRH） 是在下丘脑的弓状核中合成分泌的小分子多肽［7］。GHRH基因不仅是在种间还是种内都具有高度保守性［8］。雄性小鼠缺乏GHRH会增加体力活动［9］。牛的GHRH基因可能是影响体质量的重要因素之一［10］。GHRH 基因mRNA表达和生长性状相对于基因型（+/-）均表现出差异不显著［11］。GHRH类似物通过抗炎和抗氧特性使其在糖尿病视网膜病变早期具有保护神经血管作用［12］。 生长激素释放激素受体（growth hormone releasing hormone receptor，简称GHRHR） 在细胞增殖、生长激素合成与分泌等方面都发挥着重要作用。迄今为止仅在异种动物、鸡和斑马鱼中发现的GHRHR同时容纳GHRH和PRP［13］。GHRHR确定为GH1之后的第2个IGHD基因［14］。CREB3L2能够促进GHRHR启动子的活性［15］。

InDel多态性分子标记是基于插入/缺失位点2侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记，其本质仍属于长度多态性标记，可利用便捷的电泳平台进行分型。InDel标记准确性高、稳定性好，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。此外，InDel标记能扩增混合DNA样品和高度降解的微量DNA样品，并进行有效分型。InDel标记目前已开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域［16］。本研究以小尾寒羊为研究对象，对GHR、GHRH、GHRHR基因的InDel多态性与肉质性状进行关联分析，以此来探讨GHR、GHRH、GHRHR基因对小尾寒羊肉质性状的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取辽宁省沙地治理与利用研究所阜瑶牧业公司阜新市种羊场的小尾寒羊164只，通过颈静脉采血，并作ACD抗凝处理后的血样至于冰盒中，放入冰箱-20 ℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 肉质性状指标测定 测定指标包括滴水损失、水分、蒸煮损失、色泽、粗蛋白、粗脂肪，测量方法参考张沅主编的《家畜育种学》［17］。

1.2.2 引物设计 引物设计参考Wu等的研究［18］。并由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成，引物信息见表1。

1.2.3 PCR扩增及数据分析 PCR扩增体系 15 μL：上下游引物各 1 μL，DNA 2 μL，2×Tap PCR Master Mix 7.5 μL，dd H2O 3.5μL。PCR扩增产物用3%浓度的琼脂糖凝胶进行检测。通过SPSS 26.0软件中的一般线性模型方法进行关联分析，最终以作图形式展示关联结果。

1.2.4 试验地点与时间 试验地点为河南科技大学动物科技学院动物遗传育种实验室，试验时间为2021年4月至2022年4月。

2 结果与分析

2.1 小尾寒羊GHR、GHRH、GHRHR基因的多态性检测

从图1可以看出，GHR基因具有3种基因型，分别为II基因型、ID基因型、DD基因型。从图2可以看出，GHRH基因具有2种基因型，分别为II基因型、DD基因型。从图3可以看出，GHRHR基因具有3种基因型，分别为II基因型、ID基因型、DD基因型。

2.2 小尾寒羊GHR、GHRH、GHRHR基因的群体遗传多样性

从表1可以看出，GHR基因的II基因型频率最高，为0.625；DD基因型频率最低，仅有0.063。等位基因I的频率最多，为0.781；D的频率较少，为0.219。纯合度为0.685，杂合度为0.342，多态信息含量为0.283，在群体中处于中度多态性（0.25≤PIC＜0.50），χ2为0.235，P值为0.628>0.05，说明GHR基因符合Hardy-Weinberg平衡。

GHRH基因II基因型频率最高，为0.563；DD基因型频率较低，为0.437。等位基因I的频率最高，为0.536；D的频率最小，为0.437。纯合度为0.508，杂合度为0.492，多态信息含量为0.371，在群体中处于中度多态性（0.25≤PIC＜0.50），χ2为32.000，P值为0.000<0.001，说明GHRH基因极显著偏离Hardy-Weinberg平衡。

GHRHR基因的ID基因型频率为0.250；DD基因型频率最低，为0.062；II基因型频率最高，为0.688。等位基因I频率最高，为0.813；等位基因D频率最低，为0.187。纯合度为0.695，杂合度为0.305，多态信息含量为0.258，在群体中处于中度多态性（0.25≤PIC＜0.50），χ2为1.031，P值为0.310>0.05，说明小尾寒羊GHRHR基因位点符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3 小尾寒羊GHR、GHRH、GHRHR基因与肉质性状的关联分析

从图4可以看出，小尾寒羊GHR基因的DD基因型肉质色泽显著低于ID、II基因型（P＜0.05），而滴水损失、剪切力、水分、蒸煮损失、粗蛋白、粗脂肪在GHR基因的不同基因型之间无显著差异（P>0.05）。从图5可以看出，GHRH不同基因型对于小尾寒羊的所有肉质性状影响不显著（P>0.05）。从图6可以看出，GHRHR基因的DD基因型个体的剪切力显著高于ID、II基因型个体（P<0.05），而滴水损失、水分、蒸煮损失、色泽、粗蛋白、粗脂肪在GHRHR基因的不同基因型之间无显著差异（P>0.05）。

3 讨论与结论

目前，对于GHR、GHRH、GHRHR这3种基因的研究大多数都集中在其生长性状的相关分析，但是对于这3种基因的关于肉质性状的关联分析却较少，而且多数的研究都集中在牛等其他动物身上，有关绵羊类的研究非常少。

3.1 GHR基因的多态性

在不同年龄的西罗希山羊品种中，GHR基因的1个SNP与体质量存在显著影响［19］。GHR基因T229C位点对牛的宰前活质量、屠宰率、胴体质量、净肉率、肉骨比、脂肪覆盖率、头质量、胴体产肉率、前蹄质量、后蹄质量、大理石花纹评分和剪切力影响显著［20］。在家兔群体中，GHR基因的外显子上发现2个突变位点，分别是2 067（C/T）、1 797（T/C），在1 797（T/C）位点中不同基因型肉用性状之间使用最小二乘分析结果显示，在不同基因型个体间差异不显著（P>0.05），而2 067（C/T）突变位点在胴体质量、背腰质量、35日龄体质量、70日龄体质量、前腿质量、皮质量和后腿质量等屠宰性状及肌内蛋白质含量和干物质含量等肉质性状的最小二乘均值杂合型MN型个体显著优于MM型、NN型个体（P<0.05）［21］。本研究中GHR基因仅与小尾寒羊的肉质色泽存在显著相关性，可以推测出GHR基因可以作为小尾寒羊提升肉质品质的候选基因之一。

3.2 GHRH基因的多态性

GHRH激动剂可以减轻诱导的小鼠神经抑郁、焦虑和认知缺陷，并且降低氧化应激标志物，促红细胞生成素和胰岛素生长因子-1表达上调，并明显降低了小鼠在睡眠期间的间歇性缺氧时的水迷宫缺陷［22］。GHRH除了影响内分泌作用和代谢以外，在炎症和疼痛的调节中同样发挥作用。可以通过注射GHRH表达质粒的方法来提高绵羊的增质量和生长速率。PCR结果显示，经pM-GHRH处理后的绵羊中几乎没有质粒残留，并且也不存在器官肿大或相关的病理 ［23］。在朝鲜牛群体中，GHRH基因在9 kb全基因区域内共发现12个单核苷酸多态性，结果显示-4241A>T与EMA和CW呈显著相关，表明GHRH基因多态性可能是影响肉牛胴体产量的重要遗传因素之一［24］。本试验结果与之存在差異，这可能是由于所选的动物种类不同，而导致的结果存在差异，本试验结果中的GHRH基因与小尾寒羊肉质性状的无显著相关性，故不可以作为小尾寒羊肉质形状的候选基因。

3.3 GHRHR基因的多态性

GHRHR基因的2种单倍型的效应大于其他任何基因，表明GHRHR可能是迄今为止发现的影响人类身高正常变异的最重要基因之一［25］。 在南阳牛、陕县红牛和秦川牛中发现GHRHR的4个位点共检测出10个SNPs，而且对陕县红牛的管围存在极显著的影响（P<0.01），对其体高、体斜长、腰角宽、体质量、十字部高、尻长和胸围有显著影响（P<0.05）；对南阳牛0～6月龄平均日增质量、6月龄体质量、体斜长和6～12月龄平均日增质量有明显的影响（P<0.05）［26］。本研究中GHRHR基因仅与小尾寒羊的剪切力存在显著相关性，可以推测出GHRHR基因可以作为小尾寒羊提升肉质品质的候选基因之一。

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